实验二人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本 制备 一、实验目的 1、了解人体外周血淋巴细胞短期培养的原理及方法。 2、初步掌握人外周血淋巴细胞染色体的制备技术。 二、实验原理 健康成年人体内的淋巴细胞总数约有500×10°，其中约有2%在外周血 中循环。在外周血的淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主（每毫升血中的含量可 达13×10个)。在通常情况下，它们都处于间期的G或G期，所以很难 见到正在分裂的淋巴细胞。但是，Nowell(1960)发现，从芸豆(phaseolus vulgaris)中提取的能使红细胞凝集的物质一植物血球凝集素 (phytohemagglutinin,PHA)可以刺激淋巴细胞进行有丝分裂。在PHA的 作用下，处在G期的淋巴细胞可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期进 行有丝分裂，当体外培养至72小时左右时，大多数淋巴细胞已处于第二增 殖周期内，此时用有丝分裂的阻断剂秋水仙素(colchicine)处理细胞可使 正在分裂的细胞都停止在中期，再经低渗、固定等处理，便可得到较多可供 分析的中期染色体。以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本具有取材方 便，用血量少(0.3~1.0咖1即可)，培养简单等优点，故该方法在临床上 已得到广泛的应用。 三、实验用品 1、器材：超净工作台（或无菌接种箱）、光学显微镜（附照相装置） 隔水式恒温培养箱、干燥箱、水平式离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压蒸气 消毒锅、真空泵（或电动吸引器）、10ml刻度离心管、10ml培养瓶（可用 环磷酰胺药瓶代)、2l注射器、吸管、滴管、试管架、三角烧瓶、染色缸、 酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、塘瓷盘、铝制饭盒 消毒用酒精棉球与碘酒棉球等。 2、材料：人外周血 3、试剂：RPMI1640培养液（含1020%小牛血清）、碳酸氢钠(AR)、 PHA、青霉素、链霉素、肝素、5%NaHCO3溶液、lmol/LHC1、三蒸水或双 蒸水、0.075mol/LKC1、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液，pH6.8的磷酸缓冲 液。 4 4 实验二 人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本 制备 一、实验目的 1、了解人体外周血淋巴细胞短期培养的原理及方法。 2、初步掌握人外周血淋巴细胞染色体的制备技术。 二、实验原理 健康成年人体内的淋巴细胞总数约有 500×109，其中约有 2％在外周血 中循环。在外周血的淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主（每毫升血中的含量可 达 1~3×106 个）。在通常情况下，它们都处于间期的 G0 或 G1 期，所以很难 见到正在分裂的淋巴细胞。但是，Nowell（1960）发现，从芸豆（phaseolus vulgaris）中提取的能使红细胞凝集的物质一植物血球凝集素 （phytohemagglutinin，PHA）可以刺激淋巴细胞进行有丝分裂。在 PHA 的 作用下，处在 G0 期的淋巴细胞可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期进 行有丝分裂，当体外培养至 72 小时左右时，大多数淋巴细胞已处于第二增 殖周期内，此时用有丝分裂的阻断剂秋水仙素（colchicine）处理细胞可使 正在分裂的细胞都停止在中期，再经低渗、固定等处理，便可得到较多可供 分析的中期染色体。以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本具有取材方 便，用血量少（0.3～1.0ml 即可），培养简单等优点，故该方法在临床上 已得到广泛的应用。 三、实验用品 1、器材：超净工作台（或无菌接种箱）、光学显微镜（附照相装置）、 隔水式恒温培养箱、干燥箱、水平式离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压蒸气 消毒锅、真空泵（或电动吸引器）、10ml 刻度离心管、10ml 培养瓶（可用 环磷酰胺药瓶代）、2ml 注射器、吸管、滴管、试管架、三角烧瓶、染色缸、 酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷盘、铝制饭盒、 消毒用酒精棉球与碘酒棉球等。 2、材料：人外周血 3、试剂：RPMI l640 培养液（含 10~20％小牛血清）、碳酸氢钠（AR）、 PHA、青霉素、链霉素、肝素、5％NaHCO3 溶液、1mol／L HCl、三蒸水或双 蒸水、0.075 mol／L KCl、甲醇、冰乙酸、Giemsa 原液，pH6.8 的磷酸缓冲 液