Chinese Journal of veterinary M ed icine 中国兽医杂志200年(第43卷)第1期75 1材料与方法 家兽药安全评价中心实验动物房,试验前驯化2周 l1 Waters600型高效液相色谱仪, Waters717自每日投喂空白颗粒饵料,水温20±Q5℃ 动进样器, Waters2475型荧光检测器, m pow er色182给药方法和剂量盐酸恩诺沙星,含量98% 谱工作站,旋涡混合器,隔膜真空泵;超纯水仪:Mi其中恩诺沙星含量为92%。将药物配制成浓度为4 Q(美国);振荡器,SPE柱: Bond elut3c,20omg, mg//mI的水溶液,按5mg/kg体重剂量灌胃给药,每 Cl8(迪马公司);高速冷冻离心机 B iofuge strato s天1次连续5天,将不回吐的实验鱼用于试验。 Heraeus,德国);实验室pH计:PHSJ-4 183组织样品的采集与测定最后1次给药后第 12喹诺酮药物对照品恩诺沙星( Enrofloxa-cin)、3、6、12、24、48、%6、68、240、480、720、1416、2136h 环丙沙星( C rofloxacin)、沙拉沙星 Saraflo- xacin),采集样品,每一时间点取4尾鱼,冷冻处死后,去皮 含量≥996%(中国兽医药品监察所);双氟沙星剔骨、匀浆,处理后的肌肉组织置于-20℃冷冻保存。 ( D ofloxacin),含量为984%( S igm a ca,美国);甲样品经处理后用HPLC检测。 醇、乙腈为色谱纯磷酸二氢钾、氢氧化钠柠檬酸、乙2结果 酸铵(分析纯) 21标准曲线FQs4种药物在上述色谱条件下得 13色谱分析条件流动枏Q05mol柠檬酸+Q1到良好的分离,见图1(A)。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉 mol乙酸铵乙腈(体积比为80:20);流速:1m1沙星、双氟沙星的标准曲线回归方程分别为Y=734 min;色谱柱: InertsilODS-3(5m,46mm×250×103x+684×103、Y=767×103X+352×103Y mm);柱温:20℃;荧光检测波长Aex=280,λm= 236×103X+303×103Y=236×10xX+303 450,进样量:20lb ×103,相关系数(R2)均为Q999,线性范围均为Q1 14标准曲线绘制取适量混合标准储备液,用流~1000nghL 动相逐级稀释为1000ng/nl,500ngh1,200ng m1, 100 ng/m 1, 50 ng/ml, 10 ng/n 1, 2 ng/n L0 1 ng/nl,8个浓度,按照上述色谱条件进样,以各药物 峰面积Y对药物浓度ⅹ(ng/D进行线性回归分析。 5组织样品前处理准确称取20g组织,置于50 ⊙0.80 m1聚丙烯具塞离心管中。加入15ml提取液,涡动1 min,振荡10min,离心10mn(15000r/hmin,18℃)。 上清液转移至另一50ml离心管中,下层沉淀中复加 200400600800100012001400160018002000200 5m1提取液,重复提取1次,合并两次提取液,过SPE 柱。 将SPE柱置于固相萃取真空歧管装置上,用3ml 甲醇3m1提取液平衡柱将上一步骤20m1提取液过 柱,调整真空泵的压力,使流速约1滴/s3m1水淋洗 90 水完全流过SPE柱后,使其继续在真空下干燥3mn; 4ml流动相洗脱,收集洗脱液于5m具塞刻度试管 0.20年 中,涡动混匀。1m1注射器吸取适量洗脱液,经过滤 20040060080010012001400601800a000200 转入液相小瓶,供高效液相色谱分析。 图14种喹诺酮类药物的典型 HPLC-FLD色谱图 16检测限的测定取空白鱼肉样品,设6个平行, A)25nghl混合标准溶液,由左至右依次为 按上述样品前处理方法进行处理,得到空白鱼肉色谱 环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星 图,将信噪比SN=3作为检测限①LOD)。 (B)空白鱼肉组织 17添加回收率与精密度取空白鱼肉20g,添加22检测限取6个空白样品基线噪音值的平均 定体积的混合标准工作液,使组织中药物浓度为5、值,以信噪比为3计,鱼肉中4种药物检测限①OD) 0、100ng/g,涡动1min,静置5mi样品经处理后分别为环丙沙星03ng/g,恩诺沙星10ng/g,沙拉 进行HPC测定,每个浓度每天做3个平行样品,计沙星02ng/g,双氟沙星02ng/g空白样品色谱图 算回收率和日内变异系数,连续测定3天,计算日间见图1(B)。 变异系数 23回收率与精密度4种药物低、中高3个浓度 18鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究的样品添加回收率和日内、日间变异系数见表1 181实验动物健康鲫鱼,体重150±10g,由北24鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究 京海宁通养殖有限公司提供。饲养于中国农业大学国恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星总量的残留消 S1994-2007ChinaAcademicJOurmalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net1 材料与方法 1. 1 W aters600 型高效液相色谱仪,W aters717 自 动进样器,W aters2475 型荧光检测器, Em pow er 色 谱工作站; 旋涡混合器; 隔膜真空泵; 超纯水仪:M illi2 Q (美国); 振荡器; SPE 柱: Bond E lu t. 3cc, 200m g, C18 (迪马公司); 高速冷冻离心机: B iofuge strato s (H eraeu s, 德国); 实验室pH 计: PH SJ 24A。 1. 2 喹诺酮药物对照品 恩诺沙星(En rofloxa2cin)、 环丙沙星(C ip rofloxacin)、沙拉沙星 Saraflo2xacin) , 含量≥99. 6% (中国兽医药品监察所); 双氟沙星 (D ifloxacin) , 含量为 98. 4% (Sigm a Co. , 美国); 甲 醇、乙腈为色谱纯; 磷酸二氢钾、氢氧化钠、柠檬酸、乙 酸铵(分析纯)。 1. 3 色谱分析条件 流动相: 0. 05 m o l 柠檬酸+ 0. 1 m o l 乙酸铵2乙腈 (体积比为 80∶20); 流速: 1 m lö m in ; 色谱柱: InertsilOD S23 ( 5Λm , 4. 6 mm ×2 5 0 mm ); 柱温: 20℃; 荧光检测波长 Κex = 280, Κem = 450; 进样量: 20 Λl。 1. 4 标准曲线绘制 取适量混合标准储备液, 用流 动相逐级稀释为 1 000 ngöm l, 500 ngöm l, 200 ngö m l, 100 ngöm l, 50 ngöm l, 10 ngöm l, 2 ngöm l, 0. 1 ngöm l, 8 个浓度, 按照上述色谱条件进样, 以各药物 峰面积Y 对药物浓度X (ngöm l) 进行线性回归分析。 1. 5 组织样品前处理 准确称取2. 0 g 组织, 置于50 m l 聚丙烯具塞离心管中。加入15 m l 提取液, 涡动1 m in, 振荡10 m in, 离心10 m in (15 000 röm in, 18℃)。 上 清液转移至另一50 m l 离心管中, 下层沉淀中复加 5 m l 提取液, 重复提取1 次, 合并两次提取液, 过SPE 柱。 将 SPE 柱置于固相萃取真空歧管装置上, 用3 m l 甲醇、3 m l 提取液平衡柱; 将上一步骤20 m l 提取液过 柱, 调整真空泵的压力, 使流速约1 滴ös; 3 m l 水淋洗, 水完全流过SPE 柱后, 使其继续在真空下干燥3 m in; 4 m l 流动相洗脱, 收集洗脱液于 5 m l 具塞刻度试管 中, 涡动混匀。1 m l 注射器吸取适量洗脱液, 经过滤, 转入液相小瓶, 供高效液相色谱分析。 1. 6 检测限的测定 取空白鱼肉样品, 设6 个平行, 按上述样品前处理方法进行处理, 得到空白鱼肉色谱 图, 将信噪比SöN = 3 作为检测限(LOD )。 1. 7 添加回收率与精密度 取空白鱼肉2. 0 g, 添加 一定体积的混合标准工作液, 使组织中药物浓度为5、 20、100 ngög, 涡动1 m in, 静置15 m in。样品经处理后 进行H PL C 测定, 每个浓度每天做 3 个平行样品, 计 算回收率和日内变异系数, 连续测定 3 天, 计算日间 变异系数。 1. 8 鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究 1. 8. 1 实验动物 健康鲫鱼, 体重 150±10 g, 由北 京海宁通养殖有限公司提供。饲养于中国农业大学国 家兽药安全评价中心实验动物房, 试验前驯化 2 周, 每日投喂空白颗粒饵料, 水温20±0. 5℃。 1. 8. 2 给药方法和剂量 盐酸恩诺沙星, 含量98% , 其中恩诺沙星含量为 92%。将药物配制成浓度为 4 m göm l 的水溶液, 按5 m gökg 体重剂量灌胃给药, 每 天1 次, 连续5 天, 将不回吐的实验鱼用于试验。 1. 8. 3 组织样品的采集与测定 最后1 次给药后第 3、6、12、24、48、96、168、240、480、720、1416、2136 h 采 集样品, 每一时间点取 4 尾鱼, 冷冻处死后, 去皮、 剔骨、匀浆, 处理后的肌肉组织置于- 20℃冷冻保存。 样品经处理后用H PL C 检测。 2 结果 2. 1 标准曲线 FQ s 4 种药物在上述色谱条件下得 到良好的分离, 见图1 (A )。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉 沙星、双氟沙星的标准曲线回归方程分别为Y= 7. 34 ×103X+ 6. 84×103、Y= 7. 67×103X+ 3. 52×103、Y = 2. 36×103X + 3. 03×103、Y= 2. 36×103X + 3. 03 ×103 , 相关系数(R 2 ) 均为 0. 9999, 线性范围均为 0. 1 ～ 1 000 ngöm l。 图1 4 种喹诺酮类药物的典型HPLC-FLD 色谱图 (A ) 2. 5 ngöm l 混合标准溶液, 由左至右依次为: 环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星; (B) 空白鱼肉组织; 2. 2 检测限 取 6 个空白样品基线噪音值的平均 值, 以信噪比为 3 计, 鱼肉中 4 种药物检测限 (LOD ) 分别为: 环丙沙星0. 3 ngög, 恩诺沙星1. 0 ngög, 沙拉 沙星0. 2 ngög, 双氟沙星0. 2 ngög。空白样品色谱图 见图1 (B)。 2. 3 回收率与精密度 4 种药物低、中、高3 个浓度 的样品添加回收率和日内、日间变异系数见表1。 2. 4 鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究 恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星总量的残留消 Ch inese Journal of V eterinary M edicine 中国兽医杂志 2007 年(第43 卷) 第1 期 57