加入吲哚和氯化铵就可将丙酮酸转化为L-Irp(14g/L)。由于限制L-Trp浓度进一步提高的原 因是 Enterobacter aerogenes的丙酮酸产量不高,为了获得更高的LTrp产量, Kawasaki将 Enterobacter aerogenes'中编码色氨酸酶的基因克隆至质粒pKT90IEA上,然后转入丙酮酸生 产菌E.colW1485lip2中。在葡萄糖浓度为50gL的培养基中,最终L-Irp的产量提高到23.7 (三)休止细胞法生产丙酮酸 表5-1-4中给出的采用休止细胞法生产丙酮酸的微生物,有一些也可以用于直接发酵 法。如 Acinetobacter sp(表5-1-3)和 Debaryomyces coudert(表5-1-2)。对这两株菌来说,休 止细胞法的丙酮酸产量虽然略低于直接发酵法,但培养时间显著缩短,如 Acinetobacter sp. 由96h缩短到24h, Debaryomyces couderti则由48h缩短到10h。其缺点是操作比较繁琐 需要先培养细胞,再分离细胞,洗涤,最后才用于合成丙酮酸。也有不需要进行细胞分离 操作的报道。一个例子是,细胞先以甘油为碳源生长,待氮源(NaNO3)耗尽后加入葡萄糖 细胞由于缺氮而不能生长,自然转向积累丙酮酸。遗憾的是丙酮酸产量不高。另一个例子 是待细胞在pH45~5.5的条件下生长90h后将pH降至3.5~45,实验结果表明,这种p 控制策略可有效地抑制α-酮戊二酸的形成。其缺点是反应器结构比较复杂,培养时间也太 长。严格地说,这两个例子都不是真正意义上的休止细胞法,但由于其有别于典型的发酵 法,因此将其放至表5-1-4中进行讨论。 表5-1-4采用休止细胞法生产丙酮酸的研究情况一览 菌株 氮源温度时间丙酮酸生长因子产率反应器 acinetobacter先培养细胞,12-丙二醇282410硫胺素050摇瓶 再转化底物 p.pH4.5~55下葡萄糖NHNO330180406生长需硫0.41l 胺素,产酸 Debaryomyces先培养细胞,柑桔皮 01079添加ATP0 coudert再转化底物水解物 Enterobacter先培养细胞,葡萄糖 10361A,添加0.8 aerogenes 再转化底物 亚砷酸钠 xanthomonas氮源耗尽后加甘油烟酸30 3010.3 酵母膏 摇瓶 campestris入葡萄糖,产酸葡萄糖NO3 (四)完整细胞酶法生产丙酮酸 近年来关于酶法生产丙酮酸的研究也很热门。如利用 Acetobacter将D(-)乳酸氧化为 丙酮酸,转化率虽然较高,但由于D-(-)乳酸比L-(+)乳酸价格高得多,所以在实现工业化 方面有困难。由 Hansenula polymorpha中的乙醇酸氧化酶催化的L-乳酸氧化反应具有高底 物转化率的优点,但由于L乳酸氧化为丙酮酸的过程中会产生H2O2,如果不及时去除,丙 酮酸会被进一步氧化为乙酸。L-乳酸在价格方面是非常有优势的,目前的关键是如何解决 丙酮酸被HO进一步氧化的问题。已经开发出一些方法,如,利用 Pichia pastoris中的过 氧化氢酶来分解乳酸氧化过程中产生的H2O2。在这一方面,美国杜邦公司开展了大量的研 究工作,但迄今为止,还未见到工业化成功的消息5 加入吲哚和氯化铵就可将丙酮酸转化为L-Trp(14 g/L)。由于限制L-Trp浓度进一步提高的原 因是Enterobacter aerogenes的丙酮酸产量不高，为了获得更高的L-Trp产量，Kawasaki 将 Enterobacter aerogenes中编码色氨酸酶的基因克隆至质粒pKT901EA上，然后转入丙酮酸生 产菌E. coli W1485lip2中。在葡萄糖浓度为50 g/L的培养基中，最终L-Trp的产量提高到23.7 g/L。 (三)休止细胞法生产丙酮酸 表 5-1-4 中给出的采用休止细胞法生产丙酮酸的微生物，有一些也可以用于直接发酵 法。如 Acinetobacter sp.(表 5-1-3)和 Debaryomyces coudertii(表 5-1-2)。对这两株菌来说，休 止细胞法的丙酮酸产量虽然略低于直接发酵法，但培养时间显著缩短，如 Acinetobacter sp. 由 96 h 缩短到 24 h，Debaryomyces coudertii 则由 48 h 缩短到 10 h。其缺点是操作比较繁琐∶ 需要先培养细胞，再分离细胞，洗涤，最后才用于合成丙酮酸。也有不需要进行细胞分离 操作的报道。一个例子是，细胞先以甘油为碳源生长，待氮源(NaNO3)耗尽后加入葡萄糖。 细胞由于缺氮而不能生长，自然转向积累丙酮酸。遗憾的是丙酮酸产量不高。另一个例子 是待细胞在 pH 4.5～5.5 的条件下生长 90 h 后将 pH 降至 3.5～4.5，实验结果表明，这种 pH 控制策略可有效地抑制-酮戊二酸的形成。其缺点是反应器结构比较复杂，培养时间也太 长。严格地说，这两个例子都不是真正意义上的休止细胞法，但由于其有别于典型的发酵 法，因此将其放至表 5-1-4 中进行讨论。 表5-1-4 采用休止细胞法生产丙酮酸的研究情况一览 菌株 方 法 碳源 氮源 温度 / ℃ 时间 / h 丙酮酸 / gL -1 生长因子 产率 / gg -1 反应器 Acinetobacter sp. 先培养细胞， 再转化底物 1,2-丙二醇 28 24 10 硫胺素 0.50 摇瓶 Candida sp. pH 4.5 ～5.5 下 生长，pH 3.5～ 4.5下产酸 葡萄糖 NH4NO3 30 180 40.6 生长需硫 胺素，产酸 不需要 0.41 5 L 发酵罐 Debaryomyces coudertii 先培养细胞， 再转化底物 柑桔皮 水解物 30 10 7.9 添加ATP 和NAD + 0 摇瓶 Enterobacter aerogenes 先培养细胞， 再转化底物 葡萄糖 30 10 3.6 LA-，添加 亚砷酸钠 0.8 摇瓶 Xanthomonas campestris 氮 源 耗 尽 后 加 入葡萄糖，产酸 甘油 葡萄糖 烟酸 NO3 30 30 10.3 酵母膏 0.29 摇瓶 (四)完整细胞/酶法生产丙酮酸 近年来关于酶法生产丙酮酸的研究也很热门。如利用 Acetobacter 将 D-(-)-乳酸氧化为 丙酮酸，转化率虽然较高，但由于 D-(-)-乳酸比 L-(+)-乳酸价格高得多，所以在实现工业化 方面有困难。由 Hansenula polymorpha 中的乙醇酸氧化酶催化的 L-乳酸氧化反应具有高底 物转化率的优点，但由于 L-乳酸氧化为丙酮酸的过程中会产生 H2O2，如果不及时去除，丙 酮酸会被进一步氧化为乙酸。L-乳酸在价格方面是非常有优势的，目前的关键是如何解决 丙酮酸被 H2O2 进一步氧化的问题。已经开发出一些方法，如，利用 Pichia pastoris 中的过 氧化氢酶来分解乳酸氧化过程中产生的 H2O2。在这一方面，美国杜邦公司开展了大量的研 究工作，但迄今为止，还未见到工业化成功的消息