(二)细菌或放线菌直接发酵生产丙酮酸 在已有的文献报道中,酵母积累丙酮酸一般都以葡萄糖为底物。相对而言,细菌积累 丙酮酸时所能利用的底物种类更多一些。如表5-1-3所示,能直接利用葡萄糖为底物积累 丙酮酸的细菌只有大肠杆菌(E.col。另有许多细菌能以葡萄糖酸、丙二醇和丙酸为底物生 产丙酮酸。这些细菌通常没有明显的与丙酮酸代谢有关的遗传标记,其丙酮酸产率虽然不 是很低(介于03~04gg之间),但丙酮酸产量最高仅为23g/L( Nocardia fumifera以葡萄糖 酸为底物积累丙酮酸)。如此低的产量注定这些研究在目前还只能处于实验室阶段 表5-1-3以细菌或放线菌为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览 菌株 遗传特点 碳源 氮源温度时间丙酮酸产率反应器 葡萄糖 0.38 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型葡萄糖聚胨372 发酵罐 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型,葡萄糖 聚胨372430 0.60 缺失F1-ATP酶 发酵罐 活性 Nocardia lutea 丙酸(NH4)2SO431.5722.50.25摇瓶 NHaNO3 Nocardia fiumifera 0.46 Pseudomonas tabari 葡萄糖酸(NH4SO430 摇瓶 0.26 Pseudomonas shuter 葡萄糖酸(NH4)2SO43014412 0.24 摇瓶 葡萄糖酸酵母膏30 0.32 1,2-丙二醇铵盐28 摇瓶 cinetobacter sp 硫胺素缺陷型1,2-丙二醇聚胨289611.60.58摇瓶 Pseudomo烟酸sp 1,2-丙二醇NH4NO330 与 Miyata等选育T. glabrata的多重维生素营养缺陷型不同的是, Yokota选育的E.coli w485l2遗传标记非常简单,仅为硫辛酸营养缺陷型。硫辛酸也是PDH的辅因子,在硫 辛酸亚适量供给的情况下,E. coli W1485lp2过量积累丙酮酸的原理与T. glabrata IFo0005 是基本相同的。 Yokota认为硫辛酸营养缺陷型比硫胺素营养缺陷型性能更佳,其原因是由 于硫胺素是磷酸戊糖途径中转酮酶的辅因子,故磷酸戊糖途径的活性在. glabrata的硫胺 素营养缺陷型中会受到影响,但在E.co的硫辛酸营养缺陷型中则不会。E.colW485lp2 培养32h时丙酮酸产率达0.5lgg,而以该菌株为出发菌株构建的缺失F1-ATP酶活性的 E. coli tbla-1培养24h时丙酮酸产率就达到了0.6g参见表5-1-3)。其原因是:E.col IBLA-1缺失F1-ATP酶活性后,通过氧化磷酸化途径形成的ATP减少,细胞整体能量水 平下降,葡萄糖分解速度加快,从而使得丙酮酸积累速度显著提髙 细菌发酵生产丙酮酸的另一个特点是:培养基的pH一般在70左右甚至更高一些。这意 味着可以构建一个发酵生产丙酮酸一酶法合成色氨酸的耦合系统。 Yokota和 Takao先在含50 g/葡萄糖的培养基中培养 Agaricus campe stria,待发酵液中丙酮酸产量达到2~-26g/时, 加入具有色氨酸酶活性的 Enterobacter aerogenes、吲哚和氯化铵,转化12h后L-Tp产量达 到15g/L。这一耦合系统随后又有新的发展, Yokota筛选了具有色氨酸酶活性的 Enterobacter aerogenes的硫辛酸营养缺陷型(可积累丙酮酸)。待发酵液中丙酮酸产量达到17g时,只需4 (二)细菌或放线菌直接发酵生产丙酮酸 在已有的文献报道中，酵母积累丙酮酸一般都以葡萄糖为底物。相对而言，细菌积累 丙酮酸时所能利用的底物种类更多一些。如表 5-1-3 所示，能直接利用葡萄糖为底物积累 丙酮酸的细菌只有大肠杆菌(E. coli)。另有许多细菌能以葡萄糖酸、丙二醇和丙酸为底物生 产丙酮酸。这些细菌通常没有明显的与丙酮酸代谢有关的遗传标记，其丙酮酸产率虽然不 是很低(介于 0.3～0.4 g/g 之间)，但丙酮酸产量最高仅为 23 g/L (Nocardia fumifera 以葡萄糖 酸为底物积累丙酮酸)。如此低的产量注定这些研究在目前还只能处于实验室阶段。 表5-1-3 以细菌或放线菌为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览 菌株 遗传特点 碳源 氮源 温度 / ℃ 时间 / h 丙酮酸 / gL -1 产率 / gg -1 反应器 Schizophyllum commune 葡萄糖 聚胨 27 120 19 0.38 摇瓶 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型 葡萄糖 聚胨 37 32 25.5 0.51 5 L 发酵罐 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型, 缺失F1-ATP酶 活性 葡萄糖 聚胨 37 24 30 0.60 5 L 发酵罐 Nocardia lutea 丙酸 (NH4)2SO4 NH4NO3 31.5 72 2.5 0.25 摇瓶 Nocardia fumifera 葡萄糖酸 (NH4)2SO4 30 96 23 0.46 Pseudomonas tabati 摇瓶 13 0.26 Pseudomonas stutzeri 葡萄糖酸 (NH4)2SO4 30 144 12 0.24 摇瓶 Enterococcus casseliflavus 葡萄糖酸 酵母膏 30 72 16 0.32 摇瓶 Corynebacterium sp. 1,2-丙二醇 铵盐 28 8.1 0.41 摇瓶 Acinetobacter sp. 硫胺素缺陷型 1,2-丙二醇 聚胨 28 96 11.6 0.58 摇瓶 Pseudomo烟酸s sp. 1,2-丙二醇 NH4NO3 30 72 14 0.35 摇瓶 与 Miyata 等选育 T. glabrata 的多重维生素营养缺陷型不同的是，Yokota 选育的 E. coli W1485lip2 遗传标记非常简单，仅为硫辛酸营养缺陷型。硫辛酸也是 PDH 的辅因子，在硫 辛酸亚适量供给的情况下，E. coli W1485lip2 过量积累丙酮酸的原理与 T. glabrata IFO 0005 是基本相同的。Yokota 认为硫辛酸营养缺陷型比硫胺素营养缺陷型性能更佳，其原因是由 于硫胺素是磷酸戊糖途径中转酮酶的辅因子，故磷酸戊糖途径的活性在 T. glabrata 的硫胺 素营养缺陷型中会受到影响，但在 E. coli 的硫辛酸营养缺陷型中则不会。E. coli W1485lip2 培养 32 h 时丙酮酸产率达 0.51 g/g，而以该菌株为出发菌株构建的缺失 F1-ATP 酶活性的 E. coli TBLA-1 培养 24 h 时丙酮酸产率就达到了 0.6 g/g(参见表 5-1-3)。其原因是∶E. coli TBLA-1 缺失 F1-ATP 酶活性后，通过氧化磷酸化途径形成的 ATP 减少，细胞整体能量水 平下降，葡萄糖分解速度加快，从而使得丙酮酸积累速度显著提高。 细菌发酵生产丙酮酸的另一个特点是∶培养基的pH一般在7.0左右甚至更高一些。这意 味着可以构建一个发酵生产丙酮酸─酶法合成色氨酸的耦合系统。Yokota和Takao先在含50 g/L葡萄糖的培养基中培养Agaricus campestris，待发酵液中丙酮酸产量达到22～26 g/L时， 加入具有色氨酸酶活性的Enterobacter aerogenes、吲哚和氯化铵，转化12 h后L-Trp产量达 到15 g/L。这一耦合系统随后又有新的发展，Yokota筛选了具有色氨酸酶活性的Enterobacter aerogenes的硫辛酸营养缺陷型(可积累丙酮酸)。待发酵液中丙酮酸产量达到17 g/L时，只需