2 神经解剖学杂志第25卷第4期2009年7月 薇[2]等人对上海120名孕妇进行队列研究发现，尽 度为1：400,37℃温箱，1.5h)、二抗(37℃温箱，1.0 管理论上孕期被动吸烟对胎儿神经系统有不良影 h)、三抗(37℃温箱，1.0h)、DAB显色（室温，10 响，但是统计学结果显示影响是不明显的。为了解 min)、脱水、透明和封片。用PBs缓冲液代替I抗 香烟烟雾对子鼠学习记忆能力的影响，本实验建立 重复上述过程作为阴性对照实验。 孕鼠妊娠期被动吸烟的动物模型，观察子鼠海马 1.2.4图像分析与统计学处理采用计算机图像 CaMKⅡ的表达情况，以期为优生优育学提供形态学 分析系统分别对HE染色、尼氏染色、免疫组化染色 资料。 的切片进行摄片。并测量海马CA3区神经元内 CaMKⅡ的平均光密度值。将两组子鼠海马CaMK 材料与方法 Ⅱ的平均光密度值录人SPSS11.0统计分析软件，用 两样本配对t检验分析数据。 1. 实验动物与试剂 性成熟SD大鼠由安徽医科大学实验动物中心 结 果 提供，体重180~250g,雌鼠24只，雄鼠12只。将 雌鼠随机分为实验组和对照组两组，每组12只。自 HE染色结果显示对照组子鼠海马的形态结构 制熏烟盒（约65×45×45cm大小，侧方开有约10 基本发育完全，呈现分子层、锥体细胞层和多形细胞 ×10cm的通风口)，香烟为红三环牌。一抗为美国 层(Fg.1A),其中锥体细胞层的细胞排列整齐而紧 SC公司生产的兔抗鼠CaMK二溶液，三抗为生物素 密，呈锥体状、圆球状，胞核大而圆。与对照组比较， 标记的羊抗兔1gG,三抗为复合物，二抗与三抗均为 实验组子鼠海马神经元形态和着色无明显区别 北京中杉金桥生物技术有限公司提供的美国 (Fg.1B)。尼氏染色表明，对照组子鼠海马的形态 2YMED公司SP9001试剂盒，为工作液。 结构发育完全，海马内神经元胞核染色较浅，胞质呈 1.2实验方法 翠蓝色，为胞质内尼氏体的着色(Fg.1C)。与对照 1.2.1动物模型建立与取材参照相关文献[)进行 组比较，实验组子鼠海马神经元内尼氏体形态和着 建模。实验组雌鼠在孕前10d开始被动吸烟，每日 色无明显区别(Fig.1D)。 上午、下午各1次，每次10支烟。为保持自制熏烟 对照组可见CaMKⅡ免疫阳性物主要沉积于子 盒中香烟的浓度，10支烟分3支、3支、4支的顺序 鼠海马神经元胞浆内(Fg.1E),呈棕黄色至棕褐 点燃。第10日晚上实验组和对照组两组的雌雄鼠 色，胞核呈阴性反应。与对照组比较，实验组子鼠海 均按2：1合笼，次日早晨检查阴道涂片，孕后实验组 马神经元胞浆染色较浅，呈浅黄色至棕黄色(Fg. 也同样被动吸烟。对照组不采取任何措施。饮食常 1F)。 规给予。母鼠孕21日上午，对其进行剖腹产，取子 1.图像分析结果 鼠脑组织进行固定。实验组和对照组分别随机选取 计算机图像分析系统结果显示，对照组子鼠海 10只子鼠脑组织，石蜡包埋切片（厚5μm,冠状面 马的平均光密度为0.310±0.057，实验组子鼠海马 切片)，分别做以下处理。 CaMKⅡ的平均光密度为0.192±0.029（表1）。 1.2.2HE染色与尼氏染色切片脱蜡至水，入苏 木精染色20min,再进行分色、蓝化，入伊红染色1 表1对照组和实验组子鼠海马CaMKⅡ s,脱水、透明和封片，观察结果。尼氏染色时，切片 平均光密度的比较 脱蜡至水，入甲苯胺蓝染液染色(37℃温箱，3.5h), 组别 子鼠数量 平均光密度 脱水、透明和封片，观察结果。 对照组 10 0.310±0.057 1.2.3免疫组化染色方法切片常规脱蜡至水，滴 实验组 10 0.192±0.029 *,P<0.05,与对照组比较 加3%H,02封闭内源性过氧化物酶，用微波修复抗 原后滴加正常山羊血清，再依序滴加一抗（稀释浓薇［２］ 等人对上海 １２０名孕妇进行队列研究发现，尽 管理论上孕期被动吸烟对胎儿神经系统有不良影 响，但是统计学结果显示影响是不明显的。为了解 香烟烟雾对子鼠学习记忆能力的影响，本实验建立 孕鼠妊娠期被动吸烟的动物模型，观察子鼠海马 ＣａＭＫⅡ的表达情况，以期为优生优育学提供形态学 资料。 材料与方法 １． 实验动物与试剂 性成熟 ＳＤ大鼠由安徽医科大学实验动物中心 提供，体重 １８０～２５０ｇ，雌鼠 ２４只，雄鼠 １２只。将 雌鼠随机分为实验组和对照组两组，每组 １２只。自 制熏烟盒（约 ６５×４５×４５ｃｍ大小，侧方开有约 １０ ×１０ｃｍ的通风口），香烟为红三环牌。一抗为美国 ＳＣ公司生产的兔抗鼠 ＣａＭＫ二溶液，三抗为生物素 标记的羊抗兔 ＩｇＧ，三抗为复合物，二抗与三抗均为 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 提 供 的 美 国 ２ＹＭＥＤ公司 ＳＰ９００１试剂盒，为工作液。 １．２ 实验方法 １．２．１ 动物模型建立与取材参照相关文献［３］进行 建模。实验组雌鼠在孕前 １０ｄ开始被动吸烟，每日 上午、下午各 １次，每次 １０支烟。为保持自制熏烟 盒中香烟的浓度，１０支烟分 ３支、３支、４支的顺序 点燃。第 １０日晚上实验组和对照组两组的雌雄鼠 均按 ２：１合笼，次日早晨检查阴道涂片，孕后实验组 也同样被动吸烟。对照组不采取任何措施。饮食常 规给予。母鼠孕 ２１日上午，对其进行剖腹产，取子 鼠脑组织进行固定。实验组和对照组分别随机选取 １０只子鼠脑组织，石蜡包埋切片（厚 ５μｍ，冠状面 切片），分别做以下处理。 １．２．２ ＨＥ染色与尼氏染色 切片脱蜡至水，入苏 木精染色 ２０ｍｉｎ，再进行分色、蓝化，入伊红染色 １ ｓ，脱水、透明和封片，观察结果。尼氏染色时，切片 脱蜡至水，入甲苯胺蓝染液染色（３７℃温箱，３．５ｈ）， 脱水、透明和封片，观察结果。 １．２．３ 免疫组化染色方法 切片常规脱蜡至水，滴 加 ３％Ｈ２Ｏ２ 封闭内源性过氧化物酶，用微波修复抗 原后滴加正常山羊血清，再依序滴加一抗（稀释浓 度为 １∶４００，３７℃温箱，１．５ｈ）、二抗（３７℃温箱，１．０ ｈ）、三抗（３７℃温箱，１．０ｈ）、ＤＡＢ显色（室温，１０ ｍｉｎ）、脱水、透明和封片。用 ＰＢＳ缓冲液代替Ⅰ抗 重复上述过程作为阴性对照实验。 １．２．４ 图像分析与统计学处理 采用计算机图像 分析系统分别对 ＨＥ染色、尼氏染色、免疫组化染色 的切片进行摄片。并测量海马 ＣＡ３区神经元内 ＣａＭＫⅡ的平均光密度值。将两组子鼠海马 ＣａＭＫ Ⅱ的平均光密度值录入 ＳＰＳＳ１１．０统计分析软件，用 两样本配对 ｔ检验分析数据。 结 果 ＨＥ染色结果显示对照组子鼠海马的形态结构 基本发育完全，呈现分子层、锥体细胞层和多形细胞 层（Ｆｉｇ．１Ａ），其中锥体细胞层的细胞排列整齐而紧 密，呈锥体状、圆球状，胞核大而圆。与对照组比较， 实验组子鼠海马神经元形态和着色无明显区别 （Ｆｉｇ．１Ｂ）。尼氏染色表明，对照组子鼠海马的形态 结构发育完全，海马内神经元胞核染色较浅，胞质呈 翠蓝色，为胞质内尼氏体的着色（Ｆｉｇ．１Ｃ）。与对照 组比较，实验组子鼠海马神经元内尼氏体形态和着 色无明显区别（Ｆｉｇ．１Ｄ）。 对照组可见 ＣａＭＫⅡ免疫阳性物主要沉积于子 鼠海马神经元胞浆内（Ｆｉｇ．１Ｅ），呈棕黄色至棕褐 色，胞核呈阴性反应。与对照组比较，实验组子鼠海 马神经元胞浆染色较浅，呈浅黄色至棕黄色（Ｆｉｇ． １Ｆ）。 １．图像分析结果 计算机图像分析系统结果显示，对照组子鼠海 马的平均光密度为 ０．３１０±０．０５７，实验组子鼠海马 ＣａＭＫⅡ的平均光密度为 ０．１９２±０．０２９（表 １）。 表 １ 对照组和实验组子鼠海马 ＣａＭＫⅡ 平均光密度的比较 组 别 子鼠数量 平均光密度 对照组 １０ ０．３１０±０．０５７ 实验组 １０ ０．１９２±０．０２９ ，Ｐ＜０．０５，与对照组比较 ２ 神经解剖学杂志 第 ２５卷 第 ４期 ２００９年 ７月