Jul.2009. 25(4)？-7 神经解剖学杂志 Chinese Journal of Neuroanatomy) 被动吸烟对子鼠海马神经元内钙/钙调蛋白激酶的影响” 章诗琪陈弦何倩蒋来王清华1叶寅寅 柱丽2黄大可2贾雪梅2· ('安徽医科大学第一临床学院；2安徽医科大学基础医学院综合实验室) 摘要本文通过建立实验组孕鼠被动吸烟模型，21d后剖腹产，取子鼠脑组织，采用HE染色，尼氏染色、免疫组化染色和计算 机图像分析等方法，探讨子鼠海马神经元内钙/钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表达变化。结果显示：CaMKⅡ免疫阳性产物分布于 子鼠大脑海马神经元胞质内，胞核呈阴性。对照组和实验组子鼠海马神经元内CMKⅡ平均光密度分别为0.310±0.057和0. 192±0.029(P<0.05)。上述结果证实：孕鼠妊娠期被动吸烟使子鼠海马神经元内CaMKⅡ表达减少，可能对子鼠学习记忆能 力有一定影响。 关键词 CaMKⅡ被动吸烟学习记忆子鼠 Effects of maternal passive smoking during pregnancy on the expression of Calcium/ Calmodulin-dependent Protein Kinase in the neonatal hippocampus Zhang Shiqi,Chen Xian',He Qian',Jiang Lai,Wang Qinghua', Ye Yinyin',Gui Li,Huang Dake,Jia Xuemei (The first clinical faculty of Anhui Medical University;2The Integrative Laboratory of Preclinie Department of Anhui Medical University) Abstract The objective of this study is to explore the effects of materal passive smoking during pregnancy on the expression of Calcium Calmodulin-dependent Protein Kinase (CaMK II in the neonatal hippocampus.Female Sprague-Dawley rats were randomly divided into the control group and the experimental group.The experimental group was subjected to passive smoking 10 days before pregnancy until ab- dominal delivery (21 days post-gestation).The fetal brain was removed,and brain tissues were processed for HE staining,Nissl staining, and immunohistochemistry.Image analysis was perfromed with the aid of computer.The results showed that the CaMK II immunoreactivi- ties were located in the cytoplasms of hippocampal neurons,and the nuclei were negative.The average optical densities of positive struc- tures were 0.3100.057 and 0.1920.029 in the control and experimental groups,respectively (P<0.05).The results confirm that passive smoking during pregnancy reduces the expression of CaMK lI in the neonatal hippocampus,which may impair the ability of leaming and memory of fetus. Key words passive smoking,fetus,CaMK II,learning and memory capacity 钙/钙调蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin-de- 了学习记忆的能力。唐开福)等人指出CaMKⅡ具 pendent Protein Kinase,CaMKⅡ)是空间学习和记忆 有一种特性，即Ca2+内流引起CaMKⅡ磷酸化而被 的分子基础，高表达于海马和大脑皮层的突触后致 激活，然而脑内Ca+下降后CaMKⅡ仍能保持活化 密物(PSD)中，而海马区CaMKⅡ的含量间接反映 状态，并以此推测CaMKⅡ是记忆的分子基础。赵 ①安徽省教育厅自然科学基金(2006KJ324B)资助项目 *通讯作者电话：0551-5168340E-mail:jiaxueme@126.com
书 Ｊｕｌ． ２００９ ２５（４） ？ ～？ 神 经 解 剖 学 杂 志 （ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ ） 被动吸烟对子鼠海马神经元内钙／钙调蛋白激酶的影响① 章诗琪１ 陈 弦１ 何 倩１ 蒋 来１ 王清华１ 叶寅寅１ 桂 丽２ 黄大可２ 贾雪梅２ （１安徽医科大学第一临床学院；２安徽医科大学基础医学院综合实验室） 摘 要 本文通过建立实验组孕鼠被动吸烟模型，２１ｄ后剖腹产，取子鼠脑组织，采用 ＨＥ染色、尼氏染色、免疫组化染色和计算 机图像分析等方法，探讨子鼠海马神经元内钙／钙调蛋白激酶Ⅱ（ＣａＭＫⅡ）的表达变化。结果显示：ＣａＭＫⅡ免疫阳性产物分布于 子鼠大脑海马神经元胞质内，胞核呈阴性。对照组和实验组子鼠海马神经元内 ＣａＭＫⅡ平均光密度分别为 ０．３１０±０．０５７和 ０． １９２±０．０２９（Ｐ＜０．０５）。上述结果证实：孕鼠妊娠期被动吸烟使子鼠海马神经元内 ＣａＭＫⅡ表达减少，可能对子鼠学习记忆能 力有一定影响。 关键词 ＣａＭＫⅡ 被动吸烟 学习记忆 子鼠 ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｍａｔｅｒｎａｌｐａｓｓｉｖｅｓｍｏｋｉｎｇｄｕｒｉｎｇｐｒｅｇｎａｎｃｙｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａｌｃｉｕｍ／ ＣａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅｉｎｔｈｅｎｅｏｎａｔａｌｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ＺｈａｎｇＳｈｉｑｉ１ ，ＣｈｅｎＸｉａｎ１ ，ＨｅＱｉａｎ１ ，ＪｉａｎｇＬａｉ１ ，ＷａｎｇＱｉｎｇｈｕａ１ ， ＹｅＹｉｎｙｉｎ１ ，ＧｕｉＬｉ２ ，ＨｕａｎｇＤａｋｅ２ ，ＪｉａＸｕｅｍｅｉ２ （１ＴｈｅｆｉｒｓｔｃｌｉｎｉｃａｌｆａｃｕｌｔｙｏｆＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；２ＴｈｅＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｒｅｃｌｉｎｉｃＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ＴｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｓｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍａｔｅｒｎａｌｐａｓｓｉｖｅｓｍｏｋｉｎｇｄｕｒｉｎｇｐｒｅｇｎａｎｃｙｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａｌｃｉｕｍ／ ＣａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅ（ＣａＭＫⅡ）ｉｎｔｈｅｎｅｏｎａｔａｌｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．ＦｅｍａｌｅＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｗａｓｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｐａｓｓｉｖｅｓｍｏｋｉｎｇ１０ｄａｙｓｂｅｆｏｒｅｐｒｅｇｎａｎｃｙｕｎｔｉｌａｂ ｄｏｍｉｎａｌｄｅｌｉｖｅｒｙ（２１ｄａｙｓｐｏｓｔｇｅｓｔａｔｉｏｎ）．Ｔｈｅｆｅｔａｌｂｒａｉｎｗａｓｒｅｍｏｖｅｄ，ａｎｄｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｐｒｏｃｅｓｓｅｄｆｏｒＨＥｓｔａｉｎｉｎｇ，Ｎｉｓｓｌｓｔａｉｎｉｎｇ， ａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｒｏｍｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｉｄｏｆｃｏｍｐｕｔｅｒ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＣａＭＫⅡ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉ ｔｉｅｓｗｅｒｅｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｓｏｆｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓ，ａｎｄｔｈｅｎｕｃｌｅｉｗｅｒｅｎｅｇａｔｉｖｅ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｉｅｓｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｓｔｒｕｃ ｔｕｒｅｓｗｅｒｅ０．３１０±０．０５７ａｎｄ０．１９２±０．０２９ｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｃｏｎｆｉｒｍｔｈａｔ ｐａｓｓｉｖｅｓｍｏｋｉｎｇｄｕｒｉｎｇｐｒｅｇｎａｎｃｙｒｅｄｕｃｅｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａＭＫⅡ ｉｎｔｈｅｎｅｏｎａｔａｌｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，ｗｈｉｃｈｍａｙｉｍｐａｉｒｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄｍｅｍｏｒｙｏｆｆｅｔｕｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｐａｓｓｉｖｅｓｍｏｋｉｎｇ，ｆｅｔｕｓ，ＣａＭＫⅡ，ｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙｃａｐａｃｉｔｙ 钙／钙调蛋白激酶 Ⅱ （Ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｅ ｐｅｎｄｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅ，ＣａＭＫⅡ）是空间学习和记忆 的分子基础，高表达于海马和大脑皮层的突触后致 密物（ＰＳＤ）中，而海马区 ＣａＭＫⅡ的含量间接反映 了学习记忆的能力。唐开福［１］ 等人指出 ＣａＭＫⅡ具 有一种特性，即 Ｃａ２＋内流引起 ＣａＭＫⅡ磷酸化而被 激活，然而脑内 Ｃａ２＋下降后 ＣａＭＫⅡ仍能保持活化 状态，并以此推测 ＣａＭＫⅡ是记忆的分子基础。赵 ① 安徽省教育厅自然科学基金（２００６ＫＪ３２４Ｂ）资助项目 通讯作者 电话：０５５１５１６８３４０ Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｘｕｅｍｅ＠１２６．ｃｏｍ
2 神经解剖学杂志第25卷第4期2009年7月 薇[2]等人对上海120名孕妇进行队列研究发现，尽 度为1：400,37℃温箱，1.5h)、二抗(37℃温箱，1.0 管理论上孕期被动吸烟对胎儿神经系统有不良影 h)、三抗(37℃温箱，1.0h)、DAB显色（室温，10 响，但是统计学结果显示影响是不明显的。为了解 min)、脱水、透明和封片。用PBs缓冲液代替I抗 香烟烟雾对子鼠学习记忆能力的影响，本实验建立 重复上述过程作为阴性对照实验。 孕鼠妊娠期被动吸烟的动物模型，观察子鼠海马 1.2.4图像分析与统计学处理采用计算机图像 CaMKⅡ的表达情况，以期为优生优育学提供形态学 分析系统分别对HE染色、尼氏染色、免疫组化染色 资料。 的切片进行摄片。并测量海马CA3区神经元内 CaMKⅡ的平均光密度值。将两组子鼠海马CaMK 材料与方法 Ⅱ的平均光密度值录人SPSS11.0统计分析软件，用 两样本配对t检验分析数据。 1. 实验动物与试剂 性成熟SD大鼠由安徽医科大学实验动物中心 结 果 提供，体重180~250g,雌鼠24只，雄鼠12只。将 雌鼠随机分为实验组和对照组两组，每组12只。自 HE染色结果显示对照组子鼠海马的形态结构 制熏烟盒（约65×45×45cm大小，侧方开有约10 基本发育完全，呈现分子层、锥体细胞层和多形细胞 ×10cm的通风口)，香烟为红三环牌。一抗为美国 层(Fg.1A),其中锥体细胞层的细胞排列整齐而紧 SC公司生产的兔抗鼠CaMK二溶液，三抗为生物素 密，呈锥体状、圆球状，胞核大而圆。与对照组比较， 标记的羊抗兔1gG,三抗为复合物，二抗与三抗均为 实验组子鼠海马神经元形态和着色无明显区别 北京中杉金桥生物技术有限公司提供的美国 (Fg.1B)。尼氏染色表明，对照组子鼠海马的形态 2YMED公司SP9001试剂盒，为工作液。 结构发育完全，海马内神经元胞核染色较浅，胞质呈 1.2实验方法 翠蓝色，为胞质内尼氏体的着色(Fg.1C)。与对照 1.2.1动物模型建立与取材参照相关文献[)进行 组比较，实验组子鼠海马神经元内尼氏体形态和着 建模。实验组雌鼠在孕前10d开始被动吸烟，每日 色无明显区别(Fig.1D)。 上午、下午各1次，每次10支烟。为保持自制熏烟 对照组可见CaMKⅡ免疫阳性物主要沉积于子 盒中香烟的浓度，10支烟分3支、3支、4支的顺序 鼠海马神经元胞浆内(Fg.1E),呈棕黄色至棕褐 点燃。第10日晚上实验组和对照组两组的雌雄鼠 色，胞核呈阴性反应。与对照组比较，实验组子鼠海 均按2：1合笼，次日早晨检查阴道涂片，孕后实验组 马神经元胞浆染色较浅，呈浅黄色至棕黄色(Fg. 也同样被动吸烟。对照组不采取任何措施。饮食常 1F)。 规给予。母鼠孕21日上午，对其进行剖腹产，取子 1.图像分析结果 鼠脑组织进行固定。实验组和对照组分别随机选取 计算机图像分析系统结果显示，对照组子鼠海 10只子鼠脑组织，石蜡包埋切片（厚5μm,冠状面 马的平均光密度为0.310±0.057，实验组子鼠海马 切片)，分别做以下处理。 CaMKⅡ的平均光密度为0.192±0.029（表1）。 1.2.2HE染色与尼氏染色切片脱蜡至水，入苏 木精染色20min,再进行分色、蓝化，入伊红染色1 表1对照组和实验组子鼠海马CaMKⅡ s,脱水、透明和封片，观察结果。尼氏染色时，切片 平均光密度的比较 脱蜡至水，入甲苯胺蓝染液染色(37℃温箱，3.5h), 组别 子鼠数量 平均光密度 脱水、透明和封片，观察结果。 对照组 10 0.310±0.057 1.2.3免疫组化染色方法切片常规脱蜡至水，滴 实验组 10 0.192±0.029 *,P<0.05,与对照组比较 加3%H,02封闭内源性过氧化物酶，用微波修复抗 原后滴加正常山羊血清，再依序滴加一抗（稀释浓
薇［２］ 等人对上海 １２０名孕妇进行队列研究发现，尽 管理论上孕期被动吸烟对胎儿神经系统有不良影 响，但是统计学结果显示影响是不明显的。为了解 香烟烟雾对子鼠学习记忆能力的影响，本实验建立 孕鼠妊娠期被动吸烟的动物模型，观察子鼠海马 ＣａＭＫⅡ的表达情况，以期为优生优育学提供形态学 资料。 材料与方法 １． 实验动物与试剂 性成熟 ＳＤ大鼠由安徽医科大学实验动物中心 提供，体重 １８０～２５０ｇ，雌鼠 ２４只，雄鼠 １２只。将 雌鼠随机分为实验组和对照组两组，每组 １２只。自 制熏烟盒（约 ６５×４５×４５ｃｍ大小，侧方开有约 １０ ×１０ｃｍ的通风口），香烟为红三环牌。一抗为美国 ＳＣ公司生产的兔抗鼠 ＣａＭＫ二溶液，三抗为生物素 标记的羊抗兔 ＩｇＧ，三抗为复合物，二抗与三抗均为 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 提 供 的 美 国 ２ＹＭＥＤ公司 ＳＰ９００１试剂盒，为工作液。 １．２ 实验方法 １．２．１ 动物模型建立与取材参照相关文献［３］进行 建模。实验组雌鼠在孕前 １０ｄ开始被动吸烟，每日 上午、下午各 １次，每次 １０支烟。为保持自制熏烟 盒中香烟的浓度，１０支烟分 ３支、３支、４支的顺序 点燃。第 １０日晚上实验组和对照组两组的雌雄鼠 均按 ２：１合笼，次日早晨检查阴道涂片，孕后实验组 也同样被动吸烟。对照组不采取任何措施。饮食常 规给予。母鼠孕 ２１日上午，对其进行剖腹产，取子 鼠脑组织进行固定。实验组和对照组分别随机选取 １０只子鼠脑组织，石蜡包埋切片（厚 ５μｍ，冠状面 切片），分别做以下处理。 １．２．２ ＨＥ染色与尼氏染色 切片脱蜡至水，入苏 木精染色 ２０ｍｉｎ，再进行分色、蓝化，入伊红染色 １ ｓ，脱水、透明和封片，观察结果。尼氏染色时，切片 脱蜡至水，入甲苯胺蓝染液染色（３７℃温箱，３．５ｈ）， 脱水、透明和封片，观察结果。 １．２．３ 免疫组化染色方法 切片常规脱蜡至水，滴 加 ３％Ｈ２Ｏ２ 封闭内源性过氧化物酶，用微波修复抗 原后滴加正常山羊血清，再依序滴加一抗（稀释浓 度为 １∶４００，３７℃温箱，１．５ｈ）、二抗（３７℃温箱，１．０ ｈ）、三抗（３７℃温箱，１．０ｈ）、ＤＡＢ显色（室温，１０ ｍｉｎ）、脱水、透明和封片。用 ＰＢＳ缓冲液代替Ⅰ抗 重复上述过程作为阴性对照实验。 １．２．４ 图像分析与统计学处理 采用计算机图像 分析系统分别对 ＨＥ染色、尼氏染色、免疫组化染色 的切片进行摄片。并测量海马 ＣＡ３区神经元内 ＣａＭＫⅡ的平均光密度值。将两组子鼠海马 ＣａＭＫ Ⅱ的平均光密度值录入 ＳＰＳＳ１１．０统计分析软件，用 两样本配对 ｔ检验分析数据。 结 果 ＨＥ染色结果显示对照组子鼠海马的形态结构 基本发育完全，呈现分子层、锥体细胞层和多形细胞 层（Ｆｉｇ．１Ａ），其中锥体细胞层的细胞排列整齐而紧 密，呈锥体状、圆球状，胞核大而圆。与对照组比较， 实验组子鼠海马神经元形态和着色无明显区别 （Ｆｉｇ．１Ｂ）。尼氏染色表明，对照组子鼠海马的形态 结构发育完全，海马内神经元胞核染色较浅，胞质呈 翠蓝色，为胞质内尼氏体的着色（Ｆｉｇ．１Ｃ）。与对照 组比较，实验组子鼠海马神经元内尼氏体形态和着 色无明显区别（Ｆｉｇ．１Ｄ）。 对照组可见 ＣａＭＫⅡ免疫阳性物主要沉积于子 鼠海马神经元胞浆内（Ｆｉｇ．１Ｅ），呈棕黄色至棕褐 色，胞核呈阴性反应。与对照组比较，实验组子鼠海 马神经元胞浆染色较浅，呈浅黄色至棕黄色（Ｆｉｇ． １Ｆ）。 １．图像分析结果 计算机图像分析系统结果显示，对照组子鼠海 马的平均光密度为 ０．３１０±０．０５７，实验组子鼠海马 ＣａＭＫⅡ的平均光密度为 ０．１９２±０．０２９（表 １）。 表 １ 对照组和实验组子鼠海马 ＣａＭＫⅡ 平均光密度的比较 组 别 子鼠数量 平均光密度 对照组 １０ ０．３１０±０．０５７ 实验组 １０ ０．１９２±０．０２９ ，Ｐ＜０．０５，与对照组比较 ２ 神经解剖学杂志 第 ２５卷 第 ４期 ２００９年 ７月
章诗琪等：被动吸烟对子鼠海马神经元内钙/钙调蛋白激酶的影响 3 Fig.I Photomicrographs showing the CaMKII staining of hippocampus.A and B.HE staining of fetal hippocampus in control and experi- mental groups,respectively;C and D.Nissl staining of fetal hippocampus in control and experimental groups,respectively;E and F,Immunohistochemistry for CaMkll in fetal hippocampus in control and experimental groups,respectively.Bar=100 wm in A D,50 um in E and F. 讨 论 失去携带氧的能力造成孕妇组织缺氧，胎儿的血氧 也会因此下降：胺类、氰化物可破坏支气管、肺粘膜， 吸烟对人类健康的危害众所周知，我国妇女主 从而影响母子呼吸系统功能61；尼古丁可刺激神经 动吸烟者少见，但我国男子吸烟者多，因而孕妇被动 末梢释放儿茶酚胺而使子宫肌肉及血管收缩，导致 吸烟很常见。香烟烟雾中的尼古丁、氰化物、一氧化 子宫胎盘缺血缺氧)；尼古丁还可增加脑内 碳等诱变剂、前致癌剂、肿瘤促进因子)等入血后 Caspase-3表达从而诱导细胞调亡[8)等。 可以经过胎盘进入子鼠体内，引发胚胎毒性作用 有部分研究者在致畸的同时给予干预治疗，如 [)。例如，一氧化碳与血红蛋白结合，使血红蛋白 卢岩]等人研究发现左旋精氨酸能抑制被动吸烟
Ｆｉｇ．１ ＰｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅＣａＭＫⅡ ｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．ＡａｎｄＢ，ＨＥｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｆｅｔａｌｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｉｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｅｘｐｅｒｉ ｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ＣａｎｄＤ，Ｎｉｓｓｌｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｆｅｔａｌｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｉｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｅａｎｄ Ｆ，ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｆｏｒＣａＭｋＩＩｉｎｆｅｔａｌｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｉｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｂａｒ＝１００μｍｉｎＡ Ｄ，５０μｍｉｎＥａｎｄＦ． 讨 论 吸烟对人类健康的危害众所周知，我国妇女主 动吸烟者少见，但我国男子吸烟者多，因而孕妇被动 吸烟很常见。香烟烟雾中的尼古丁、氰化物、一氧化 碳等诱变剂、前致癌剂、肿瘤促进因子［４］等入血后 可以经过胎盘进入子鼠体内，引发胚胎毒性作用 ［５］ 。例如，一氧化碳与血红蛋白结合，使血红蛋白 失去携带氧的能力造成孕妇组织缺氧，胎儿的血氧 也会因此下降；胺类、氰化物可破坏支气管、肺粘膜， 从而影响母子呼吸系统功能［６］ ；尼古丁可刺激神经 末梢释放儿茶酚胺而使子宫肌肉及血管收缩，导致 子 宫 胎 盘 缺 血 缺 氧［７］ ；尼 古 丁 还 可 增 加 脑 内 Ｃａｓｐａｓｅ３表达从而诱导细胞凋亡［８］ 等。 有部分研究者在致畸的同时给予干预治疗，如 卢岩［９］ 等人研究发现左旋精氨酸能抑制被动吸烟 章诗琪等：被动吸烟对子鼠海马神经元内钙／钙调蛋白激酶的影响 ３
4 神经解剖学杂志第25卷第4期2009年7月 的子鼠脑内氧自由基的释放，从而减轻细胞损伤，促 碍[)，尼古丁的缩血管作用可导致脑内神经元营养 进子鼠生长发育。姜丽娜o等人发现维生素E和 障碍，胞内酶成熟也会因此减少。CaMKⅡ减少后， 槲皮素可增强机体抗氧化系统，从而减轻小鼠的海 再有刺激到达海马引起CaMKⅡ自身磷酸化反应就 马损伤，进而改善其学习记忆等能力。 比原先的反应程度低，由此推测子鼠的学习记忆能 CaMK是一类由钙/钙调蛋白(calmodulin, 力受到影响。 CaM)激活的丝氨酸蛋白激酶。其中CaMKⅡ是最 吸烟是当前能人为避免的疾病危险因素之一。 早发现也是研究得较多的一类CaMK。其功能主要 对胎儿来说，母亲在妊娠期被动吸烟是一种隐匿的 有：调节突触囊泡循环与神经递质释放：调节微管装 致病形式[2)。而怀孕妇女无论在家中还是公共场 配：且在学习与记忆过程中起重要作用)。CaMK 所，接触香烟烟雾的可能性很大。本实验通过建立 Ⅱ是脑内含量最丰富的激酶之一，尤其在海马中大 动物模型反映被动吸烟对胎鼠的影响，提示妊娠期 量表达。一般情况下，CaMKⅡ以非磷酸化、Ca2+依 妇女要尽量避免被动吸烟，以免造成子代学习记忆 赖性状态存在。外部刺激到达海马引起神经元去极 能力下降的缺憾。 化，Ca2+内流，使CaM构象改变，后者与CaMKⅡ结 合使其自身磷酸化从而活化，而一段时间脑内 (收稿2008-11-07)】 Ca2+下降后CaMKⅡ仍能保持活化状态（即长时程 增强)，并以此推测海马内CaMKⅡ的表达对学习记 忆起着重要作用)。长时程增强必须依赖海马 参考文献 CA1区和CA3区同时放电，其中我们选择观察 CA3区CaMKⅡ的表达变化来反映学习记忆的改 [1]唐开福，张银辉，袁建刚.CKⅡ在学习和记忆中的作用.生 变。 物工程进展，2002；21：50-53 「2]赵薇，颜崇淮，吴胜虎.孕期被动吸烟对胎儿生长和婴儿神 本实验结果表明孕鼠妊娠期被动吸烟会引起子 经发育的影响.中国儿童保健杂志，1999：7：146-148 鼠海马CA3区CaMKⅡ表达的减少，间接提示孕鼠 [3]王东，于向民。被动吸烟致神经管缺陷的形态学观察.卫生 被动吸烟对子鼠的学习记忆产生负面影响。马太 研究，2004：33：147-151 芳5]等人发现孕鼠胚胎期接触香烟烟雾引起脑内 【4]李芳兰，马太芳.被动吸烟对子代学习记忆及海马生长抑素的 生长抑素含量下降，从而导致学习记忆能力下降。 影响.中华国际医学杂志，2002：2：49-50 周雯惠[16]等人发现孕期被动吸烟使新生鼠仔NM- 【5]颜永红，马瑛桓，王秀明.被动吸烟对怀孕小鼠胚胎发育的影 响.辽宁医学杂志，2002：3：17-18 DA受体NR1亚基减少，从而影响子鼠学习记忆能 [6]魏中书.香烟烟雾中的有害物质.前车之鉴，2007：36 力。我们的实验结果支持他们的结论。 [7]Slotkin TA.Fetal nicotine or cocaine exposure:which one is worse. 我们考虑孕鼠妊娠期被动吸烟引起子鼠海马区 J Pharmacol Exp Ther,1998;285:931-945 CaMKⅡ表达减少的可能机制有：(1)香烟烟雾中的 [8]李曼，翟秀岩.急性暴露尼古丁对未成年大鼠脑内神经元 一氧化碳和氰化物等引起机体缺氧，缺氧导致脑内 Caspase-3表达及调亡的影响.解剖学报，2006：37：504-508 〔9]卢岩，李书琴，吴旭.左旋精氨酸对被动吸烟孕鼠作用的 ATP生成减少，所以胞膜上钠泵交换减少，则Na- 实验研究.广东医学，2005：26：164-166 Ca2+交换减少，Ca2+在神经元内聚集；胞膜上钙泵 [10]姜丽娜，栗学军，李君文.被动吸烟对仔鼠学习记忆功能影响 交换减少也导致Ca2+在神经元内聚集。同时，尼古 及干预效应.中国公共卫生，2006：22：306-307 丁作用于脑内神经元细胞膜上的尼古丁乙酰胆碱受 [11]Colbran RJ.Regulatino and role of brain calcium/calmodulin-deg- 体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)使阳离 endent protein kinase U.Neurochem Int,1992:21:469 子内流川，是Ca2*在神经元内聚集的另一原因。 [12]李燕华，孙善全.大鼠脑出血后血肿周围Ca2·浓度的变化与 磷酸化CMKⅡ表达的实验研究.中风与神经疾病杂志，2004： 而由于Ca2+的聚集，神经元内更多的CaMKⅡ自身 21:7-9 磷酸化，则CMKⅡ相对减少。(2)被动吸烟可导致 [13]姚泰主编.生理学.北京：人民卫生出版社，2001：360-361 体内过氧化物歧化酶的减少，过氧化物聚集，诱导神 [14]关新民主编.医学神经生物学.北京：人民卫生出版社，2004： 经元的凋亡[18]；尼古丁也可增加脑内Caspase-3表 360-363 [15]马太芳，郭熙贤，李芳兰.被动吸烟对大鼠后代学习记忆功能 达诱导细胞调亡，而凋亡的神经元内所有的酶，包括 及海马内生长抑素含量的影响.中国现代医学杂志，2000：2： CaKⅡ自然减少了。(3)被动吸烟可引起脑内神 48 经生长因子表达的减少，导致神经元发育成熟障 〔16]周雯慧，周春，张元珍等.孕期被动吸烟对大鼠新生鼠仔海
的子鼠脑内氧自由基的释放，从而减轻细胞损伤，促 进子鼠生长发育。姜丽娜［１０］等人发现维生素 Ｅ和 槲皮素可增强机体抗氧化系统 ，从而减轻小鼠的海 马损伤 ，进而改善其学习记忆等能力。 ＣａＭＫ是 一 类 由 钙／钙 调 蛋 白 （ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ， ＣａＭ）激活的丝氨酸蛋白激酶。其中 ＣａＭＫⅡ是最 早发现也是研究得较多的一类 ＣａＭＫ。其功能主要 有：调节突触囊泡循环与神经递质释放；调节微管装 配；且在学习与记忆过程中起重要作用［１１］ 。ＣａＭＫ Ⅱ是脑内含量最丰富的激酶之一，尤其在海马中大 量表达。一般情况下，ＣａＭＫⅡ以非磷酸化、Ｃａ２＋依 赖性状态存在。外部刺激到达海马引起神经元去极 化，Ｃａ２＋内流，使 ＣａＭ构象改变，后者与 ＣａＭＫⅡ结 合使其自身磷酸化从而活化［１２］ ，而一段时间脑内 Ｃａ２＋下降后 ＣａＭＫⅡ仍能保持活化状态（即长时程 增强），并以此推测海马内 ＣａＭＫⅡ的表达对学习记 忆起着重要作用［１３］ 。长时程增强必须依赖海马 ＣＡ１区和 ＣＡ３区同时放电［１４］ ，其中我们选择观察 ＣＡ３区 ＣａＭＫⅡ的表达变化来反映学习记忆的改 变。 本实验结果表明孕鼠妊娠期被动吸烟会引起子 鼠海马 ＣＡ３区 ＣａＭＫⅡ表达的减少，间接提示孕鼠 被动吸烟对子鼠的学习记忆产生负面影响。马太 芳［１５］ 等人发现孕鼠胚胎期接触香烟烟雾引起脑内 生长抑素含量下降，从而导致学习记忆能力下降。 周雯惠［１６］ 等人发现孕期被动吸烟使新生鼠仔 ＮＭ ＤＡ受体 ＮＲ１亚基减少，从而影响子鼠学习记忆能 力。我们的实验结果支持他们的结论。 我们考虑孕鼠妊娠期被动吸烟引起子鼠海马区 ＣａＭＫⅡ表达减少的可能机制有：（１）香烟烟雾中的 一氧化碳和氰化物等引起机体缺氧，缺氧导致脑内 ＡＴＰ生成减少，所以胞膜上钠泵交换减少，则 Ｎａ＋ Ｃａ２＋交换减少，Ｃａ２＋在神经元内聚集；胞膜上钙泵 交换减少也导致 Ｃａ２＋在神经元内聚集。同时，尼古 丁作用于脑内神经元细胞膜上的尼古丁乙酰胆碱受 体（ｎｉｃｏｔｉｎｉｃａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｎＡＣｈＲｓ）使阳离 子内流［１７］ ，是 Ｃａ２＋在神经元内聚集的另一原因。 而由于 Ｃａ２＋的聚集，神经元内更多的 ＣａＭＫⅡ自身 磷酸化，则 ＣａＭＫⅡ相对减少。（２）被动吸烟可导致 体内过氧化物歧化酶的减少，过氧化物聚集，诱导神 经元的凋亡［１８］ ；尼古丁也可增加脑内 Ｃａｓｐａｓｅ３表 达诱导细胞凋亡，而凋亡的神经元内所有的酶，包括 ＣａＭＫⅡ自然减少了。（３）被动吸烟可引起脑内神 经生长因子表达的减少，导致神经元发育成熟障 碍［１９］ ，尼古丁的缩血管作用可导致脑内神经元营养 障碍，胞内酶成熟也会因此减少。ＣａＭＫⅡ减少后， 再有刺激到达海马引起 ＣａＭＫⅡ自身磷酸化反应就 比原先的反应程度低，由此推测子鼠的学习记忆能 力受到影响。 吸烟是当前能人为避免的疾病危险因素之一。 对胎儿来说，母亲在妊娠期被动吸烟是一种隐匿的 致病形式［２０］ 。而怀孕妇女无论在家中还是公共场 所，接触香烟烟雾的可能性很大。本实验通过建立 动物模型反映被动吸烟对胎鼠的影响，提示妊娠期 妇女要尽量避免被动吸烟，以免造成子代学习记忆 能力下降的缺憾。 （收稿 ２００８－１１－０７） 参 考 文 献 ［１］唐开福，张银辉，袁建刚．ＣａＭＫⅡ在学习和记忆中的作用．生 物工程进展，２００２；２１：５０－５３ ［２］赵 薇，颜崇淮，吴胜虎．孕期被动吸烟对胎儿生长和婴儿神 经发育的影响．中国儿童保健杂志，１９９９；７：１４６－１４８ ［３］王 东，于向民．被动吸烟致神经管缺陷的形态学观察．卫生 研究，２００４；３３：１４７－１５１ ［４］李芳兰，马太芳．被动吸烟对子代学习记忆及海马生长抑素的 影响．中华国际医学杂志，２００２；２：４９－５０ ［５］颜永红，马瑛桓，王秀明．被动吸烟对怀孕小鼠胚胎发育的影 响．辽宁医学杂志，２００２；３：１７－１８ ［６］魏中书．香烟烟雾中的有害物质．前车之鉴，２００７：３６ ［７］ＳｌｏｔｋｉｎＴＡ．Ｆｅｔａｌｎｉｃｏｔｉｎｅｏｒｃｏｃａｉｎｅｅｘｐｏｓｕｒｅ：ｗｈｉｃｈｏｎｅｉｓｗｏｒｓｅ． ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ，１９９８；２８５：９３１－９４５ ［８］李 曼，翟秀岩．急性暴露尼古丁对未成年大鼠脑内神经元 Ｃａｓｐａｓｅ３表达及凋亡的影响．解剖学报，２００６；３７：５０４－５０８ ［９］卢 岩，李书琴，吴 旭．左旋精氨酸对被动吸烟孕鼠作用的 实验研究．广东医学，２００５；２６：１６４－１６６ ［１０］姜丽娜，栗学军，李君文．被动吸烟对仔鼠学习记忆功能影响 及干预效应．中国公共卫生，２００６；２２：３０６－３０７ ［１１］ＣｏｌｂｒａｎＲＪ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｏａｎｄｒｏｌｅｏｆｂｒａｉｎｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｅｇ ｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＵ．ＮｅｕｒｏｃｈｅｍＩｎｔ，１９９２；２１：４６９ ［１２］李燕华，孙善全．大鼠脑出血后血肿周围 Ｃａ２＋浓度的变化与 磷酸化 ＣａＭＫⅡ表达的实验研究．中风与神经疾病杂志，２００４； ２１：７－９ ［１３］姚泰主编．生理学．北京：人民卫生出版社，２００１：３６０－３６１ ［１４］关新民主编．医学神经生物学．北京：人民卫生出版社，２００４： ３６０－３６３ ［１５］马太芳，郭熙贤，李芳兰．被动吸烟对大鼠后代学习记忆功能 及海马内生长抑素含量的影响．中国现代医学杂志，２０００；２： ４８ ［１６］周雯慧，周 春，张元珍 等．孕期被动吸烟对大鼠新生鼠仔海 ４ 神经解剖学杂志 第 ２５卷 第 ４期 ２００９年 ７月
章诗琪等：被动吸烟对子鼠海马神经元内钙/钙调蛋白激酶的影响 5 马超微结构及NMDA受体NR1亚基的影响.现代妇产科进展， [19]李芳兰，马太芳.孕鼠被动吸烟对子代学习记忆功能及海马神 2004:3:210-213 经生长因子含量的影响.解剖学报，2003：34：205-207 [17]江开达主编.精神病学.北京：人民卫生出版社，2005：106- [20]Ruben D.Baler et al.Is fetal brain monoamine oxidise inhibition 107 the missing link between matemal smoking and conduct disorders? [18]李琰，汪晖.孕期吸烟饮酒对仔鼠体格和神经发育的影 J Psychiatry Neurosci,2008;33:187 -195 响.营养学报，2004：26：354-357
马超微结构及 ＮＭＤＡ受体 ＮＲ１亚基的影响．现代妇产科进展， ２００４；３：２１０－２１３ ［１７］江开达主编．精神病学．北京：人民卫生出版社，２００５：１０６－ １０７ ［１８］李 琰，汪 晖．孕期吸烟饮酒对仔鼠体格和神经发育的影 响．营养学报，２００４；２６：３５４－３５７ ［１９］李芳兰，马太芳．孕鼠被动吸烟对子代学习记忆功能及海马神 经生长因子含量的影响．解剖学报，２００３；３４：２０５－２０７ ［２０］ＲｕｂｅｎＤ．Ｂａｌｅｒｅｔａｌ．Ｉｓｆｅｔａｌｂｒａｉｎｍｏｎｏａｍｉｎｅｏｘｉｄｉｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｈｅｍｉｓｓｉｎｇｌｉｎｋｂｅｔｗｅｅｎｍａｔｅｒｎａｌｓｍｏｋｉｎｇａｎｄｃｏｎｄｕｃｔｄｉｓｏｒｄｅｒｓ？ ＪＰｓｙｃｈｉａｔｒｙＮｅｕｒｏｓｃｉ，２００８；３３：１８７－１９５ 章诗琪等：被动吸烟对子鼠海马神经元内钙／钙调蛋白激酶的影响 ５
