急性C0中毒小鼠海马神经元超微结构及Bc-2/Bax观察 吴松王露何莹莹任晶晶王铁涛吴银燕 (安徽医科大学，05本硕) 指导老师：贾雪梅教授 [摘要]目的探讨急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning, ACOP)后小鼠海马神经元的超微结构及Bc-2和Bax表达情况。方法取 16只小鼠，随机分为实验组8只，对照组8只，实验组进行急性一氧化碳 中毒，7天后，断头取脑，冰冻切片，HE染色、电镜观察、免疫组化染色并 做计算机图像分析。结果HE染色结果显示对照组与实验组结果无明显差 别。与对照组相比，在电镜下，实验组海马神经元内线粒体肿胀，空泡化； 粗面内质网扩张，变少；髓鞘松解，出现核沟等细胞调亡前的形态学特征。 免疫组化染色结果，实验组Bcl-2/Bax比值为0.889±.0081(P<0.05)；对照 组Bcl-2/Bax比值为1.523±.0050(P<0.05)。结论急性一氧化碳中毒有诱 发小鼠海马神经元调亡的趋势，为临床上迟发性脑病病理研究提供形态学依 据。 [关健词]急性一氧化碳中毒，Bc-2,Bax,超微结构，海马，小鼠 在我国北方，急性C0中毒很常见，但约有3%-30%急性C0中毒患者恢复 后会出现神经系统的病变（迟发型脑病），表现为计算力显著下降、记忆力 减退、反应迟钝、部分患者可发展为痴呆综合征。机制目前仍不清楚，大量 研究表明记忆与海马有关，本实验通过复制急性C0中毒小鼠模型，用电镜技 术观察小鼠海马神经元超微结构的变化。1993年KorsmeyerL1-提出 Bcl-2/Bax比率可以调控细胞死亡，于是本实验将通过免疫组化技术检测小
急性 CO 中毒小鼠海马神经元超微结构及 Bcl-2/Bax 观察 吴松 王露 何莹莹 任晶晶 王铁涛 吴银燕 （安徽医科大学，05 本硕） 指导老师：贾雪梅教授 [摘要] 目的 探讨急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning， ACOP）后小鼠海马神经元的超微结构及 Bcl-2 和 Bax 表达情况。 方法 取 16 只小鼠，随机分为实验组 8 只，对照组 8 只，实验组进行急性一氧化碳 中毒，7 天后，断头取脑，冰冻切片，HE 染色、电镜观察、免疫组化染色并 做计算机图像分析。结果 HE 染色结果显示对照组与实验组结果无明显差 别。与对照组相比，在电镜下，实验组海马神经元内线粒体肿胀，空泡化； 粗面内质网扩张，变少；髓鞘松解，出现核沟等细胞凋亡前的形态学特征。 免疫组化染色结果，实验组 Bcl-2/Bax 比值为 0.889±.0081 (P<0.05)；对照 组 Bcl-2/Bax 比值为 1.523±.0050 (P<0.05)。结论 急性一氧化碳中毒有诱 发小鼠海马神经元凋亡的趋势，为临床上迟发性脑病病理研究提供形态学依 据。 [关键词] 急性一氧化碳中毒，Bcl-2，Bax，超微结构，海马，小鼠 在我国北方，急性CO中毒很常见，但约有 3%~30%急性CO中毒患者恢复 后会出现神经系统的病变（迟发型脑病），表现为计算力显著下降、记忆力 减退、反应迟钝、部分患者可发展为痴呆综合征。机制目前仍不清楚，大量 研究表明记忆与海马有关，本实验通过复制急性CO中毒小鼠模型，用电镜技 术观察小鼠海马神经元超微结构的变化。1993 年KorsmeyerL[1-2]提出 Bcl-2/Bax比率可以调控细胞死亡，于是本实验将通过免疫组化技术检测小
鼠海马神经元凋亡相关蛋白bcl-2（抑制凋亡)和bax(促进凋亡)的表达情 况，通过对照分析，从而观察急性C0中毒小鼠海马神经元是否有凋亡的趋势， 期望为临床上迟发性脑病病理研究提供形态学依据。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1动物20只昆明小鼠，体重20-25g,雌雄各半，由安徽医科大学实 验动物中心提供（普通级）。 1.1.2试剂C0(自制)，HE染料，4%戊二醛固定液，PBS,免疫组化试剂 盒。 1.1.3仪器冰冻切片机，光学显微镜，电镜（日立JM-1230)。 1.2方法 1.2.1ACOP模型构建取16只昆明种小鼠半随机分为两组，对照组8只， 实验组8只。每天给模型组小鼠进行C0中毒，（中午1次，晚上1次），连续 中毒7天，对照组不吸入C0,同样条件下饲养。第8天，用C0处死实验组 小鼠，颈椎脱臼处死对照组小鼠，取出脑组织，分别作以下处理。 1.2.2HE染色技术苏木精染色，分色，蓝化，脱水，复制伊红染色，分 色，脱水，透明，封片。 1.2.3电镜技术在海马齿状回平面切一约1组织块，放入4%戊二醛固定， 环氧乙烷处理，环氧树脂包埋，包埋组织超薄切片，枸橼酸铅染液，水洗， 日产JEM-1230型透射电镜观察摄片。 1.2.4免疫组化染色技术脑组织冰冻切片，厚度为10mm,固定，过氧 化氢处理，8min;血清封闭，室温孵育15min,倒去，勿洗，滴加一抗（兔抗鼠）
鼠海马神经元凋亡相关蛋白bcl-2（抑制凋亡）和bax（促进凋亡）的表达情 况，通过对照分析，从而观察急性CO中毒小鼠海马神经元是否有凋亡的趋势， 期望为临床上迟发性脑病病理研究提供形态学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物 20 只昆明小鼠，体重 20-25g，雌雄各半，由安徽医科大学实 验动物中心提供（普通级）。 1.1.2 试剂 CO（自制），HE 染料，4%戊二醛固定液，PBS，免疫组化试剂 盒。 1.1.3 仪器 冰冻切片机 ，光学显微镜 ，电镜 （日立 JEM-1230）。 1.2 方法 1.2.1 ACOP 模型构建 取 16 只昆明种小鼠半随机分为两组,对照组 8 只， 实验组 8 只。 每天给模型组小鼠进行 CO 中毒,(中午 1 次,晚上 1 次),连续 中毒 7 天，对照组不吸入 CO，同样条件下饲养。第 8 天, 用 CO 处死实验组 小鼠,颈椎脱臼处死对照组小鼠，取出脑组织，分别作以下处理。 1.2.2 HE 染色技术 苏木精染色，分色，蓝化，脱水，复制伊红染色，分 色，脱水，透明，封片。 1.2.3 电镜技术 在海马齿状回平面切一约 1 组织块，放入 4%戊二醛固定， 环氧乙烷处理，环氧树脂包埋，包埋组织超薄切片，枸橼酸铅染液，水洗， 日产 JEM-1230 型透射电镜观察摄片。 1．2.4 免疫组化染色技术 脑组织冰冻切片，厚度为 10mm，固定，过氧 化氢处理, 8min;血清封闭,室温孵育 15min ,倒去,勿洗，滴加一抗（兔抗鼠）
37孵育，滴加二抗（羊抗兔），37孵育；滴加复合物，DAB显色，冲洗。 以上步操作后用PBS洗3次，5min/次。透明，封片，光学显微镜摄片。以 PBS替代一抗做空白对照实验。 1.2.5计算机图像分析对免疫组化染色的小鼠海马CA3区，用计算机形 态分析系统，进行阳性细胞光密度分析。 1.2.6统计学处理采用SSPS分析软件处理数据，数据用X±S表示。 2结果 2.1HE染色结果对照组小鼠海马神经元染色较浅，细胞核大且圆，核仁明 显，胞浆较少。实验组小鼠海马神经元染色浅，排列紊乱，细胞核出现椭圆， 胞浆较多，但总体情况与对照组相同，无明显变化。 2.2电镜结果对照组小鼠海马神经元内粗面内质网较多，呈线状；线粒体 丰富，呈椭圆形，嵴清晰；核糖体及糖原颗粒丰富，核膜清晰，染色质弥散 于核中，可见核仁（图1)。髓鞘正常无松解现象（图2。实验组中粗面内 质网扩张明显；线粒体肿胀，嵴变少，甚至空泡化；细胞水肿，核糖体及糖 原颗粒稀疏，细胞核染色质固缩（图3）。有髓鞘松解（图4）
37 孵育，滴加二抗（羊抗兔）, 37 孵育；滴加复合物， DAB 显色，冲洗。 以上步操作后用 PBS 洗 3 次，5min /次。透明，封片，光学显微镜摄片。以 PBS 替代一抗做空白对照实验。 1.2.5 计算机图像分析 对免疫组化染色的小鼠海马 CA3 区，用计算机形 态分析系统，进行阳性细胞光密度分析。 1.2.6 统计学处理 采用 SSPS 分析软件处理数据，数据用 X±S 表示。 2 结果 2.1 HE 染色结果 对照组小鼠海马神经元染色较浅,细胞核大且圆,核仁明 显，胞浆较少。实验组小鼠海马神经元染色浅，排列紊乱，细胞核出现椭圆， 胞浆较多，但总体情况与对照组相同，无明显变化。 2.2 电镜结果 对照组小鼠海马神经元内粗面内质网较多，呈线状；线粒体 丰富，呈椭圆形，嵴清晰；核糖体及糖原颗粒丰富，核膜清晰，染色质弥散 于核中，可见核仁（图 1）。髓鞘正常无松解现象（图 2）。实验组中粗面内 质网扩张明显；线粒体肿胀，嵴变少，甚至空泡化；细胞水肿，核糖体及糖 原颗粒稀疏，细胞核染色质固缩（图 3）。有髓鞘松解（图 4）
图1对照组小鼠海马CA3区神经元细胞核（★）图2对照组小鼠海马CA3区髓鞘（△） 核膜清晰（☆）线粒体（↑），及粗面内质网（▲） 结构正常×15,000 结构正常×20,000 图3实验组小鼠海马CA3区神经元神经元细 图4实验组小鼠海马CA3区髓鞘松散（△） 胞核质固缩（★），核膜皱褶（☆），线粒体空泡化 ×15,000 (↑)，粗面内质网内膜扩张（▲）×20,000 2.3免疫组化染色结果对照组小鼠海马神经元Bc-2表达于胞质，呈深棕 黄色（图5）；Bx表达于胞质，呈淡棕黄色（图6）。实验组小鼠海马神 经元Bcl-2呈浅黄色（图7）Bax呈深棕色（图8）
图 1 对照组小鼠海马 CA3 区神经元细胞核（★） 图 2 对照组 小鼠海马 CA3 区髓鞘（△） 核膜清晰（☆）线粒体（↑），及粗面内质网（▲） 结构正常×15,000 结构正常×20,000 图 3 实验组 小鼠海马 CA3 区神经元神经元细 图 4 实验组 小鼠海马 CA3 区髓鞘松散（△） 胞核质固缩（★），核膜皱褶（☆），线粒体空泡化 ×15,000 （↑），粗面内质网内膜扩张（▲）×20,000 2.3 免疫组化染色结果 对照组小鼠海马神经元 Bcl-2 表达于胞质，呈深棕 黄色（图 5）； Bax 表达于胞质，呈淡棕黄色（图 6）。 实验组小鼠海马神 经元 Bcl-2 呈浅黄色（图 7）；Bax 呈深棕色（图 8）
50um 50um 图5对照组海马CA3区神经元Bcl-2(SP法)图6对照组海马CA3区神经元bax(SP法) 50um 50um 图7实验组海马CA3区神经元Bcl-2(SP法)图8实验组海马CA3区神经元bax(SP法) 2.4图像分析结果：对照组小鼠海马神经元细胞中Bcl-2和Bax表达的平 均光密度分别为0.142±0.0042和0.093±0.0056，Bcl-2/Bax比值为1.523± 0.0050。实验组小鼠海马神经元细胞中Bcl-2和Bax表达的平均光密度分别 为0.101±0.0076和0.113±0.0100，Bc-2/Ba×比值为0.889±0.0081
图 5 对照组海马 CA3 区神经元 Bcl-2（SP 法） 图 6 对照组海马 CA3 区神经元 bax（SP 法） 图 7 实验组海马 CA3 区神经元 Bcl-2（SP 法） 图 8 实验组海马 CA3 区神经元 bax（SP 法） 2.4 图像分析结果： 对照组小鼠海马神经元细胞中 Bcl-2 和 Bax 表达的平 均光密度分别为 0.142±0.0042 和 0.093±0.0056，Bcl-2/Bax 比值为 1.523± 0.0050。实验组小鼠海马神经元细胞中 Bcl-2 和 Bax 表达的平均光密度分别 为 0.101±0.0076 和 0.113±0.0100，Bcl-2/Bax 比值为 0.889±0.0081
小鼠海马神经元Bcl-2、Bax表达平均光密度(X±S)及其比值 指标 对照组 实验组 n 8 8 Bcl-2 0.142±0.0042 0.101±0.0076* Bax 0.093±0.0056 0.113±0.0097 Bcl-2/Bax 1.523±0.0050 0.889±0.0081* 注：实验组与对照组相比较，*P<0.05,有统计学意义。 3讨论 急性C0中毒是临床常见病，许多患者出院后出现一系列的精神症状（临 床上称为迟发性脑病)，本文章通过复制中毒模型，电镜技术和免疫组化技 术，来观察小鼠海马神经元形态的改变，从而来探讨临床上急性C0中毒后 迟发性脑病的机制。 在小鼠中毒7天后，电镜观察小鼠海马神经元细胞，与对照组相比，实 验组小鼠海马神经元线粒体肿胀，嵴空泡化，粗面内质网肿胀，细胞核染色 质固缩边集，核皱缩甚至形成调亡小体。结果与Cheng-Yu Chenl等做的急 性C0中毒后MR结果相同。产生上述超微结构可能原因为，急性C0中毒后，会 导致组织缺氧，细胞线粒体功能、代谢损伤，最后累及细胞核，使染色质固 缩，最终可使神经元细胞凋亡【1。这些改变是细胞由细胞质损伤向不可逆的 细胞核损伤转变的过程。 同时通过免疫组化技术检测凋亡蛋白的表达情况，Bc1-2是最重要的凋 析切片，与对照组相比，实验组Bcl-2表达下降，而Bax表达升高，Bcl-2/Bax 比值小于1(P<0.05),BCl-2基因促进细胞生存，Bax基因促进细胞调亡
小鼠海马神经元 Bcl-2、 Bax 表达平均光密度( X±S)及其比值 指标 对照组 实验组 n Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax 8 0.142±0.0042 0.093±0.0056 1.523±0.0050 8 0.101±0.0076* 0.113±0.0097* 0.889±0.0081* 注：实验组与对照组相比较，*P<0.05，有统计学意义。 3 讨论 急性 CO 中毒是临床常见病，许多患者出院后出现一系列的精神症状（临 床上称为迟发性脑病），本文章通过复制中毒模型，电镜技术和免疫组化技 术，来观察小鼠海马神经元形态的改变，从而来探讨临床上急性 CO 中毒后 迟发性脑病的机制。 在小鼠中毒 7 天后,电镜观察小鼠海马神经元细胞, 与对照组相比，实 验组小鼠海马神经元线粒体肿胀，嵴空泡化，粗面内质网肿胀，细胞核染色 质固缩边集，核皱缩甚至形成凋亡小体。结果与Cheng-Yu Chen1 [3]等做的急 性CO中毒后MR结果相同。产生上述超微结构可能原因为，急性CO中毒后，会 导致组织缺氧，细胞线粒体功能、代谢损伤，最后累及细胞核，使染色质固 缩，最终可使神经元细胞凋亡［4］ 。这些改变是细胞由细胞质损伤向不可逆的 细胞核损伤转变的过程。 同时通过免疫组化技术检测凋亡蛋白的表达情况，Bcl-2 是最重要的凋 析切片，与对照组相比，实验组Bcl-2 表达下降，而Bax表达升高，Bcl-2/Bax 比值小于 1（ P<0.05），Bcl-2 基因促进细胞生存，Bax基因促进细胞凋亡
Bc1-2/Bax小于1，细胞调亡率高6。由此提示急性C0中毒后小鼠海马神经元 有凋亡趋势。 综合上述电镜和免疫组化结果，我们试图解释急性C0中毒诱发小鼠海 马神经元调亡机制。BC1-2蛋白分布于线粒体外膜的胞浆面、内质网表面及 核膜上，具有稳定线粒体膜的功能。当急性C0中毒后，小鼠海马神经元细 胞缺氧，使线粒体肿胀，嵴空泡化，膜通透性改变，Bcl-2表达下降，Bax 表达升高，使转变孔开放，线粒体释放细胞色素C,激活caspase酶， 促使细胞调亡，最终出现电镜下小鼠海马神经元细胞核染色质固缩边集，核 皱缩等形态学改变。 临床上急性C0中毒后，患者在急性症状消失后，出现计算力显著下降、 记忆力减退、反应迟钝等迟发脑病症状。据本实验结果明确了急性CO中毒 后可导致海马神经元损伤，富强四等曾提出的神经生长因子对神经元有修复 作用，结合本实验结果，提示临床上可以通过维持细胞功能的措施来减低迟 发性脑病的症状，从而提高急性CO中毒患者生存质量。 本文章同时应用免疫组化技术和电镜技术来描述急性CO中毒后小鼠海 马神经元变化。具有一定的应用价值。实验结果为临床上迟发型脑病提供了 形态学基础，其分子机制有待进一步探讨
Bcl-2/Bax小于 1，细胞凋亡率高[6]。由此提示急性CO中毒后小鼠海马神经元 有凋亡趋势。 综合上述电镜和免疫组化结果，我们试图解释急性 CO 中毒诱发小鼠海 马神经元凋亡机制。Bcl-2 蛋白分布于线粒体外膜的胞浆面、内质网表面及 核膜上，具有稳定线粒体膜的功能。当急性 CO 中毒后，小鼠海马神经元细 胞缺氧，使线粒体肿胀，嵴空泡化，膜通透性改变，Bcl-2 表达下降，Bax 表达升高，使转变孔开放 ，线粒体释放细胞色素 C ，激活 caspase 酶 ， 促使细胞凋亡，最终出现电镜下小鼠海马神经元细胞核染色质固缩边集，核 皱缩等形态学改变。 临床上急性CO中毒后，患者在急性症状消失后，出现计算力显著下降、 记忆力减退、反应迟钝等迟发脑病症状。据本实验结果明确了急性CO中毒 后可导致海马神经元损伤，富强[7]等曾提出的神经生长因子对神经元有修复 作用，结合本实验结果，提示临床上可以通过维持细胞功能的措施来减低迟 发性脑病的症状，从而提高急性CO中毒患者生存质量。 本文章同时应用免疫组化技术和电镜技术来描述急性CO中毒后小鼠海 马神经元变化。具有一定的应用价值。实验结果为临床上迟发型脑病提供了 形态学基础，其分子机制有待进一步探讨
参考文献 [1]Korsmeyer SJ,Shutter JR,Veis DJ,at al.Bcl-2/Bax:a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death[J].Semin Cancer Biol,1993,4(6):327-332 [2]Korsmeyer SJ.BCL-2 gene family and the regulation of programmed cell death[J].Cancer Res,1999,59:1693-1700 [3]Chung-Ping Lol.Cheng-Yu Chen1.Chun-Jen Hsuehl Brain Injury After Acute Carbon Monoxide Poisoning:Early and Late Complications J].AJR 2007; 189:205-211 [4]Susin sa .zamzamin mitochondria as regulators of apoptosis[J].Biochim biophys acta1998,1366(1-2):151-165 [5]Oltvai ZN,Milkman CL,KorsmeyerSJ .Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved hornolog Bax tha that accelerates programmed cell death[J.Cell,1993,74(4):609一619 [6]Selvakumaran M,Lin HK,Miyashita T,et al.Immediate early upergulation of bax expression by p53 but not TGF beta 1:a paradigm for distinct apoptotic pathways[J].Oncogene,1994,9:1791-1798 [)]富强，李波.神经生长因子对机械性损伤大鼠脑皮质神经元的修复作用。 哈尔滨医科大学学报，2008,42(3)：42-45
参考文献 [1]Korsmeyer SJ ,Shutter JR ,Veis DJ,at al .Bcl-2/Bax: a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death[J].Semin Cancer Biol,1993，4(6):327-332 [2]Korsmeyer SJ.BCL-2 gene family and the regulation of programmed cell death[ J].Cancer Res,1999，59:1693 一 1700 [3]Chung-Ping Lo1.Cheng-Yu Chen1.Chun-Jen Hsueh1 Brain Injury After Acute Carbon Monoxide Poisoning: Early and Late Complications [ J]. AJR 2007; 189:205–211 [4] Susin sa .zamzamin mitochondria as regulators of apoptosis[ J]. Biochim biophys acta 1998，1366(1-2) ：151-165 [5]Oltvai ZN,Milkman CL,KorsmeyerSJ .Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved hornolog,Bax,tha that accelerates programmed cell death[ J].Cell,1993,74(4):609 一 619 [6]Selvakumaran M ,Lin HK,Miyashita T ,et al.Immediate early upergulation of bax expression by p53 but not TGF beta 1:a paradigm for distinct apoptotic pathways[ J].Oncogene,1994,9:1791 一 1798 [7]富强, 李波. 神经生长因子对机械性损伤大鼠脑皮质神经元的修复作用。 哈尔滨医科大学学报 ，2008, 42（3）：42-45
Observe the Bcl-2/Bax and microscope change after ACOP in mice anhui medical university Wu Song wang lu He Yingying Instructor Jia Xuemei [Abstract]Objective:To evaluate the expression of the apoptosis associated genes Bax and Bcl-2 in the hippocampus,as well as to study their ratio and observe its seahorse neuron the electron microscope change after ACOP,in order to investigate a new therapy of delayed encephalopathy.Methods: After ACOP for 7 days,freezing slices were prepared from the hippocampus of each mice.then detect the expressions of both genes,depending on the immunohistochemical technique and then electron microscope observe seahorse neuron cell organ morphology change.Results:Compared with the group for operation,Under the electron microscope Cytoplasma internal parting line plastochondria swelling obvious break,vanishing,even the vacuole,the rough finish endoplasmic reticulum expands;Myelinic membrane loose solution;Subsequently appears the karyotheca obvious expansion,appears the size different nuclear ditch,cells and so on karyopyknosis to perish weakly the front morphological character.the value of Bcl-2/Bax was 0.889+.0081 (P<0.05),Comparedt to 1.523 +.0050(P<0.05)in the group of control. Conclusion The result above showed neuron cell apoptosis in hippocampal which play a important role in the mechanism of delyed encephalopathy after carbon monoxide poisoning. [Key words]acute carbon monoxide poisoning Bcl-2,Bax,Electron microscope,hippocampus,mice
Observe the Bcl-2/Bax and microscope change after ACOP in mice anhui medical university Wu Song wang lu He Yingying Instructor Jia Xuemei [Abstract] Objective: To evaluate the expression of the apoptosis associated genes Bax and Bcl-2 in the hippocampus, as well as to study their ratio and observe its seahorse neuron the electron microscope change after ACOP ,in order to investigate a new therapy of delayed encephalopathy. Methods: After ACOP for 7 days ,freezing slices were prepared from the hippocampus of each mice. then detect the expressions of both genes, depending on the immunohistochemical technique and then electron microscope observe seahorse neuron cell organ morphology change. Results : Compared with the group for operation, Under the electron microscope Cytoplasma internal parting line plastochondria swelling obvious break, vanishing, even the vacuole, the rough finish endoplasmic reticulum expands; Myelinic membrane loose solution; Subsequently appears the karyotheca obvious expansion, appears the size different nuclear ditch, cells and so on karyopyknosis to perish weakly the front morphological character . the value of Bcl-2/Bax was 0.889±.0081 (P<0.05), Comparedt to 1.523±.0050 (P<0.05) in the group of control . Conclusion ：The result above showed neuron cell apoptosis in hippocampal which play a important role in the mechanism of delyed encephalopathy after carbon monoxide poisoning. [Key words] acute carbon monoxide poisoning ，Bcl-2, Bax, Electron microscope，hippocampus ,mice