第六节药物的抗病毒实验 一、目的和要求 1.掌握药物体外抗病毒的实验方法和操作步 骤。 2.熟悉病毒感染性动物模型的建立和评价
第六节 药物的抗病毒实验 一、目的和要求 1.掌握药物体外抗病毒的实验方法和操作步 骤。 2.熟悉病毒感染性动物模型的建立和评价
二、内容 (一)原理 病毒是一类结构简单、非细胞形态的专性细 胞内寄生的微生物，必须在易感的活的动物 鸡胚或细胞内才能进行复制增殖。因此可用 动物、鸡胚或细胞来进行病毒培养和药物的 抗病毒试验。可通过观察细胞培养液酸碱度 的变化、病毒致细胞病变效应(CPE)、病 毒滴度(PFU)改变、病毒基因组mRNA水 平变化、鸡胚尿囊液或动物血清等相应指标 的改变，来判断药物的抗病毒试验效果
二、内容 （一）原理 病毒是一类结构简单、非细胞形态的专性细 胞内寄生的微生物，必须在易感的活的动物、 鸡胚或细胞内才能进行复制增殖。因此可用 动物、鸡胚或细胞来进行病毒培养和药物的 抗病毒试验。可通过观察细胞培养液酸碱度 的变化、病毒致细胞病变效应（CPE）、病 毒滴度（PFU）改变、病毒基因组mRNA水 平变化、鸡胚尿囊液或动物血清等相应指标 的改变，来判断药物的抗病毒试验效果
(二)材料 1.9~10d日龄鸡胚，壳白净且厚薄均匀的鸡 卵（莱亨鸡的受精卵由于卵壳薄，在孵育 过程中便于检查，为首选) 2.Hep-2细胞或MDCK细胞 3.病毒：如IFV(FM1株)、RSV(Long株) 4.药物：试验药物，阳性对照药 5.动物：小鼠等 (三)操作方法
（二）材料 1. 9~10 d日龄鸡胚，壳白净且厚薄均匀的鸡 卵（莱亨鸡的受精卵由于卵壳薄，在孵育 过程中便于检查，为首选） 2. Hep-2细胞或MDCK细胞 3.病毒：如IFV（FM1株）、RSV（Long株） 4.药物：试验药物，阳性对照药 5.动物：小鼠等 （三）操作方法
一)鸡胚法 鸡胚培养为常用的病毒培养法之一，目 前主要用于痘类病毒、粘病毒、疱疹病毒 的分离、鉴定、制备抗原和疫苗的生产等。 1.接种方法 病毒的鸡胚培养法主要有四种接种途径， 即尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊， 不同的病毒应选择各自适宜的接种途径， 并根据接种途径确定鸡胚的孵育日龄（见 表)。下面将以流感病毒为例进行说明
鸡胚培养为常用的病毒培养法之一，目 前主要用于痘类病毒、粘病毒、疱疹病毒 的分离、鉴定、制备抗原和疫苗的生产等。 1.接种方法 病毒的鸡胚培养法主要有四种接种途径， 即尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊， 不同的病毒应选择各自适宜的接种途径， 并根据接种途径确定鸡胚的孵育日龄（见 表）。下面将以流感病毒为例进行说明。 一）鸡胚法
表6-1鸡胚孵育日龄及接种途径选择 接种病毒名称 接种部位 鸡胚日龄 收获材料 痘类病毒、 绒毛尿囊膜 9-10 绒毛尿囊膜 单纯疱疹病毒 流感病毒、 尿囊腔 9-11 尿囊液 腮腺炎病毒 流感病毒初次分离 羊膜腔 12-14 羊水 某些嗜神经性病毒 卵黄囊 5-6 卵黄液
• 表6-1 鸡胚孵育日龄及接种途径选择 接种病毒名称 接种部位 鸡胚日龄 收获材料 痘类病毒、 单纯疱疹病毒 绒毛尿囊膜 9-10 绒毛尿囊膜 流感病毒、 腮腺炎病毒 尿囊腔 9-11 尿囊液 流感病毒初次分离 羊膜腔 12-14 羊水 某些嗜神经性病毒 卵黄囊 5-6 卵黄液
2.IFV-FM1的50%鸡胚感染量(EID50)测定 用生理盐水将病毒作10倍系列稀释，分别 接种鸡胚，0.1ml/胚，同时设正常对照， 共6组，每组5胚。35℃孵育72h,置4°℃冰 箱过夜，收集尿囊液做血凝试验，按Reed- Muench法计算FM1的EID5o
2. IFV-FM1的50%鸡胚感染量（EID50）测定 用生理盐水将病毒作10倍系列稀释，分别 接种鸡胚，0.1ml /胚，同时设正常对照， 共6组，每组5胚。35℃孵育72 h，置4℃冰 箱过夜，收集尿囊液做血凝试验，按ReedMuench法计算FM1的EID50
3.药物对鸡胚的毒性作用 选用健康的9~11日龄鸡胚，消毒备用。将 受试药和对照药作10倍系列稀释5~6个浓度， 如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、 100μg/ml、10μg/ml,每个浓度接种5胚， 0.25ml/胚。35℃培养5d后观察结果（死 亡/存活)。确定两种药物对鸡胚的最大无 毒剂量(TCo),用于正式实验
3. 药物对鸡胚的毒性作用 选用健康的9~11日龄鸡胚，消毒备用。将 受试药和对照药作10倍系列稀释5~6个浓度， 如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、 100μg/ml、10μg/ml，每个浓度接种5胚， 0.25ml /胚。35℃培养5 d后观察结果（死 亡/存活）。确定两种药物对鸡胚的最大无 毒剂量（TC0），用于正式实验
4.药物对FM1的抑制作用 鸡胚随机分为14组，每组5胚，即试验药 的六个剂量组（从T℃，开始作10倍系列稀 释)、阳性对照药六个剂量组（同前）、 生理盐水和病毒对照组。将不同浓度的药 液注入鸡胚中，0.25ml/胚，30min后经相 同途径注入100EID50病毒0.1ml,对照组以 生理盐水代替。35℃温箱孵育5d。收获尿 囊液，测其血凝效价，以能抑制32倍以上 所注射的最小药物量，即为其最小抑制剂 量(MIC)
4. 药物对FM1的抑制作用 鸡胚随机分为14组，每组5胚，即试验药 的六个剂量组（从TC0开始作10倍系列稀 释）、阳性对照药六个剂量组（同前）、 生理盐水和病毒对照组。将不同浓度的药 液注入鸡胚中，0.25ml /胚，30 min后经相 同途径注入100 EID50病毒0.1ml，对照组以 生理盐水代替。35℃温箱孵育5 d。收获尿 囊液，测其血凝效价，以能抑制32倍以上 所注射的最小药物量，即为其最小抑制剂 量（MIC）
4.1鸡胚接种 (1)孵育9~10d左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔 标出气室和胎位。 (2)鸡胚直立于固定架上，气室端向上，按常规以 碘酒，酒精消毒。 (3)用磨蛋器在气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。 (4)用I注射器吸取病毒悬液，针头从气室小孔 刺入，沿胚胎的长轴刺入0.5~1.0cm深度；此时 针头已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒悬液。 (5)拔出针头，用镊子将胶布沾酒精烧灼后将小孔 封闭，置于35~36°℃温箱内培养二天，每天翻动 两次，用照蛋灯检视一次。培养二天后。置- 20°C冰箱2h后，无菌操作收获尿囊液
4.1鸡胚接种 （1）孵育9~10 d左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔 标出气室和胎位。 （2）鸡胚直立于固定架上，气室端向上，按常规以 碘酒，酒精消毒。 （3）用磨蛋器在气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。 （4）用lml注射器吸取病毒悬液，针头从气室小孔 刺入，沿胚胎的长轴刺入0.5~1.0cm深度；此时 针头已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒悬液。 （5）拔出针头，用镊子将胶布沾酒精烧灼后将小孔 封闭，置于35~36℃温箱内培养二天，每天翻动 两次，用照蛋灯检视一次。培养二天后。置 - 20℃冰箱2 h后，无菌操作收获尿囊液
4.2尿囊液的收获 (1)从冰箱中取出鸡胚，用碘酒，酒精消毒 气室部位。 (2)用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的 卵壳 (3)用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸 取尿囊液（避免血管破裂），置于无菌试 管中 (4)获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑 制试验（定性），判断病毒的增殖情况并 对病毒进行鉴定；同时做无菌实验
4.2尿囊液的收获 （1）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒，酒精消毒 气室部位。 （2）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的 卵壳。 （3）用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸 取尿囊液（避免血管破裂），置于无菌试 管中。 （4）获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑 制试验（定性），判断病毒的增殖情况并 对病毒进行鉴定；同时做无菌实验