第五节 乙肝五项指标检测 (ELISA双抗体夹心法) 一、目的和要求 掌握乙肝五项指标检测的ELISA方法
第五节 乙肝五项指标检测 （ELISA双抗体夹心法） 一、目的和要求 掌握乙肝五项指标检测的ELISA方法
二、内容 (一)原理 乙型肝炎的微生物学检查中以抗原抗体检测 最常用，其中尤以酶联免疫吸附试验 (ELISA 为主，采用双抗体夹心法（一步法）。如乙肝表 面抗原(HBsAg)检测：包被马抗-HBs的单克隆 抗体于微孔板上，血清标本中HBsAg与其结合后， 再加入辣根过氧化酶(HRP)标记的抗-HBs,结 果形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶的底 物后使底物显色
二、内容 （一）原理 乙型肝炎的微生物学检查中以抗原抗体检测 最常用，其中尤以酶联免疫吸附试验（ELISA） 为主，采用双抗体夹心法（一步法）。如乙肝表 面抗原（HBsAg）检测：包被马抗-HBs的单克隆 抗体于微孔板上，血清标本中HBsAg与其结合后， 再加入辣根过氧化酶（HRP）标记的抗-HBs，结 果形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶的底 物后使底物显色
(二)材料 1.疑似乙型肝炎患者待检血清。 2.检测HBV“两对半”血清标志(HBsAg) 的ELISA试剂盒：包被有相应抗体或抗原的 反应条，酶结合物，阳性与阴性对照，洗 涤液，显色剂A、B,终止液
（二）材料 1.疑似乙型肝炎患者待检血清。 2.检测HBV“两对半”血清标志（HBsAg） 的ELISA试剂盒：包被有相应抗体或抗原的 反应条，酶结合物，阳性与阴性对照，洗 涤液，显色剂A、B，终止液
(三)操作方法 参照所购试剂盒的操作说明书进行 1.乙肝表面抗原(HBsAg)检测 (1)每孔加待测血清50u,每板设HBsAg阳 性、阴性及空白对照各一孔；再向每孔加 入酶结合物50μ！（空白孔不加)，用不干胶 封孔后，37℃水浴30min。 (2)弃去孔内液体，用洗涤液注满每孔，弃 去拍干，反复5次 (3)每孔加显色剂A、B各一滴，37C孵育 10min后加终止液一滴(2mol/LH2S04, 50l),终止反应
（三）操作方法 参照所购试剂盒的操作说明书进行 1.乙肝表面抗原（HBsAg）检测 （1）每孔加待测血清50μl，每板设HBsAg阳 性、阴性及空白对照各一孔；再向每孔加 入酶结合物50μl（空白孔不加），用不干胶 封孔后，37℃水浴30min。 （2）弃去孔内液体，用洗涤液注满每孔，弃 去拍干，反复5次。 （3）每孔加显色剂A、B各一滴，37℃孵育 10min后加终止液一滴（2mol/L H2SO4， 50μl），终止反应
结果判断： (1)目测法：阳性对照呈蓝色、阴性及空白 对照为无色，以此为依据来判断标本孔。 (2)比色法：以空白孔调零，用酶标仪测 492nm吸光度，读取各孔A值，以标本吸 光度A值/阴性对照吸光度A值≥2.1者判为 阳性
结果判断： （1）目测法：阳性对照呈蓝色、阴性及空白 对照为无色，以此为依据来判断标本孔。 （2）比色法：以空白孔调零，用酶标仪测 492 nm吸光度，读取各孔A值，以标本吸 光度A值/阴性对照吸光度A值 ≥ 2.1者判为 阳性
2.乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs)、e抗原 (HBeAg)检测 取出相应检测试剂盒中的包被板（或条） 进行同1的操作，结果观察亦同1（略）
2.乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）、e抗原 （HBeAg）检测 取出相应检测试剂盒中的包被板（或条） 进行同1的操作，结果观察亦同1（略）
3.乙型肝炎病毒核心抗体（抗-HBc)、e抗体 (抗-HBe)检测 (1)抗-HBC检测先用生理盐水将待测血清 作1：30稀释，然后取50μ加入相应的包被板 (或条)中，同时设阳性、阴性及空白对 照各一孔（对照血清不必稀释）；再向每 孔加入酶结合物50！（空白孔不加），再进 行同1的操作。但结果观察需反看：目测法 是以不显色（无色）孔为阳性；比色法是 以标本吸光度A值>0.5N(阴性对照值)为 阴性，标本吸光度A值≤0.5N者判为阳性
3.乙型肝炎病毒核心抗体（抗-HBc）、e抗体 （抗-HBe）检测 （1）抗-HBc检测 先用生理盐水将待测血清 作1:30稀释，然后取50μl加入相应的包被板 （或条）中，同时设阳性、阴性及空白对 照各一孔（对照血清不必稀释）；再向每 孔加入酶结合物50μl（空白孔不加），再进 行同1的操作。但结果观察需反看：目测法 是以不显色（无色）孔为阳性；比色法是 以标本吸光度A值>0.5N（阴性对照值）为 阴性，标本吸光度A值≤0.5N者判为阳性
(2)抗-HBe检测取出相应的包被板（或条）， 每孔加待测血清50，同时设立对照，每孔加 中和试剂50！（试剂盒中配备），再加入酶结 合物50ul(空白孔不加)，然后进行同抗-HBc 检测的操作过程，结果观察亦同抗-HBc,需反 看
（2）抗-HBe检测 取出相应的包被板（或条）， 每孔加待测血清50μl，同时设立对照，每孔加 中和试剂50μl（试剂盒中配备），再加入酶结 合物50μl（空白孔不加），然后进行同抗-HBc 检测的操作过程，结果观察亦同抗-HBc，需反 看
三、作业 撰写实验小论文1篇。 四、思考题 简述乙肝五项指标各自的医学意义？ (黄升海)
三、作业 撰写实验小论文1篇。 四、思考题 简述乙肝五项指标各自的医学意义？ （黄升海）