人类染色体标本的制备 及G显带核型分析 安徽医科大学基础医学院生物学教研室
人类染色体标本的制备 及G显带核型分析 安徽医科大学基础医学院生物学教研室
[目的和要求] 1.掌握染色体标本的制备方法和G显带技术。 2. 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及G显带 染色体的核型分析技术
[目的和要求] 1. 掌握染色体标本的制备方法和G显带技术。 2. 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及G显带 染色体的核型分析技术
[实验原理] 染色体作为细胞遗传信息的载体， 出现于有丝分 裂期。用于人类染色体标本制备的材料可为骨髓细胞、 外周血淋巴细胞、绒毛细胞、羊水细胞等。其中最简 便的就是抽取少量外周静脉血进行短期培养，经秋水 仙素处理（秋水仙素可阻断有丝分裂期细胞中微管的 聚集，使纺锤体不能形成，从而使有丝分裂停滞在中 期时相，此时染色体具有最典型的形态)，再经低渗， 固定等处理，获得更多的中期分裂相以用于核型分析
[实验原理] 染色体作为细胞遗传信息的载体，出现于有丝分 裂期。用于人类染色体标本制备的材料可为骨髓细胞、 外周血淋巴细胞、绒毛细胞、羊水细胞等。其中最简 便的就是抽取少量外周静脉血进行短期培养，经秋水 仙素处理（秋水仙素可阻断有丝分裂期细胞中微管的 聚集，使纺锤体不能形成，从而使有丝分裂停滞在中 期时相，此时染色体具有最典型的形态），再经低渗、 固定等处理，获得更多的中期分裂相以用于核型分析
一尖美昊不翠管程支、 ,每条 体上沿纵轴显出的一定数量、，着芭程度不同 的特征。，染色体G显带是多种显带技术中的一 种，是 蒋染色体棕本经胰强白酶处理后再角青姆萨 Giemsa),染液染色。G显带技术因其方法简便 重复性好，带纹清晰直可长期保存而应用最为广泛。 核是指 体细胞有丝分裂中期的所有染色体 形 正顺序排列所构成的国係。每 一个体细胞含有两组同样的染色体，用2表示。 染色体核型分析是细胞遗传学的重要研究手段，在 临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断 及研究书具有重要意义
◼ 染色体的带纹是染色体标本经过特殊处理后，每条 染色体上沿纵轴显示出的一定数量、着色程度不同、 宽窄不等的横纹。染色体带是染色体固有的、稳定 的特征。染色体G显带是多种显带技术中的一种，是 将染色体标本经胰蛋白酶处理后再用吉姆萨 （Giemsa）染液染色。G显带技术因其方法简便， 重复性好，带纹清晰且可长期保存而应用最为广泛。 ◼ 核型是指一个体细胞有丝分裂中期的所有染色体， 并按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。每 一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。 ◼ 染色体核型分析是细胞遗传学的重要研究手段，在 临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断 及研究中具有重要意义
基因组与核型 基因组：生物体内单倍体染色体组成叫做生物体的基 因组(genome),它代表了一个生物体染色体中储存 的全部遗传信息。 人类体细胞的正常核型 组 染色体号 主要特征 天A组 123 中央着丝粒染色体 亚中着丝粒染色体 B组 4 5 亚中着丝粒染色体、无随体 C组 6- 12、X 亚中着丝粒染色体 D组 13 -15 近端着丝粒染色体、有随体 E组 171618 中央着丝粒染色体 亚中着丝粒染色体 F组 19 —20 中央着丝粒染色体 小G组 21- 22、Y 近端着丝粒染色体、有随体 染色体略大、长臂平行伸展、无随体
人类体细胞的正常核型 组 染色体号 主要特征 A组 B组 C组 D组 E组 F组 G组 1 2 3 亚中着丝粒染色体 中央着丝粒染色体 4 ———— 5 亚中着丝粒染色体、无随体 6 ———— 12、X 亚中着丝粒染色体 大 小 13 ———— 15 近端着丝粒染色体、有随体 16 17 18 亚中着丝粒染色体 中央着丝粒染色体 19 ———— 20 中央着丝粒染色体 21————22、Y 近端着丝粒染色体、有随体 Y染色体略大、长臂平行伸展、无随体 基因组与核型 基因组：生物体内单倍体染色体组成叫做生物体的基 因组(genome)，它代表了一个生物体染色体中储存 的全部遗传信息
eKn 品黑 8翠米 淄粉 公K 得战好粥粥_出 4B5 -12 器脂粥 12 福6情A 9 轻9 二 10 12 13 D15 Kh防从 1D一15 16E一18 的G出 0 的F特 石经 用 正常核型（左：女性 右：男性) 正常男性：46，XY 16 17 18 正常女性：46，XX 显带染色体：用特殊的染色方法使 D E 染色体沿其长轴显示 20 21 22 出明暗交替或染色深 浅不同的横纹—带。 G 正常人体细胞染色体带型模式图
显带染色体： p q 3 2 1 1 2 3 4 6 4 3 2 1 5 2 1 3 1 2 1 2 1 2 3 5 4 1 2 1 3 2 4 用特殊的染色方法使 染色体沿其长轴显示 出明暗交替或染色深 浅不同的横纹——带。 正常男性：46，XY 正常女性：46，XX 正常人体细胞染色体带型模式图
[实验用品] 1·.器具：采血器具、超净工作台、培养瓶、恒温 培养箱、恒温水浴锅、10l刻度离心管、低 速离心机、量筒、载玻片、托盘天平、光学 显微镜、染缸、电吹风、酒精灯、剪刀、胶水。 ■2.材料：人外周静脉血。 .试剂：RPMI-1640培养液、小牛血清、肝素、 植 物血凝素(PHA)、 秋水仙素(20μg/ml)、 0.075mol/L氯化钾低渗液、0.85%生理盐水、 固定液（甲醇：冰醋酸=3：1，现配现用)、 Giemsa原液、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲 液
[实验用品] ◼ 1．器具：采血器具、超净工作台、培养瓶、恒温 培养箱、恒温水浴锅、10 ml刻度离心管、低 速离心机、量筒、载玻片、托盘天平、光学 显微镜、染缸、电吹风、酒精灯、剪刀、胶水。 ◼ 2．材料：人外周静脉血。 ◼ 3．试剂：RPMI-1640培养液、小牛血清、肝素、 植 物血凝素（PHA）、秋水仙素(20μg/ml)、 0.075 mol/L氯化钾低渗液、0.85%生理盐水、 固定液（甲醇:冰醋酸=3:1，现配现用）、 Giemsa原液、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲 液
[实验步骤] (一)人类外周血染色体标本的制备 1.采集人外周静脉血1m,迅速与适量肝素混匀抗凝。 2.超净工作台内将抗凝血加入RPMI-1640培养液中 每 瓶加0.3~0.5ml全血。轻轻混匀。 3.37°C恒温培养箱静置培养72h左右（培养24h后水平 轻摇培养瓶一次，以悬浮混匀血细胞) 。 4.培养至68~72h（即终止培养前2~4h),每瓶加秋 水仙素(20μg/ml)至终浓度0.1~0.2g/ml,轻摇 培养瓶混匀，继续培养2~4h。 5.终止培养，将培养物吹打混匀后转移到10l玻璃离 心管，配平，1800rpm离心6min
[实验步骤] ◼ (一)人类外周血染色体标本的制备 ◼ 1．采集人外周静脉血1ml，迅速与适量肝素混匀抗凝。 ◼ 2. 超净工作台内将抗凝血加入RPMI-1640培养液中， 每 瓶加0.3～0.5 ml全血。轻轻混匀。 ◼ 3. 37℃恒温培养箱静置培养72 h左右（培养24 h后水平 轻摇培养瓶一次，以悬浮混匀血细胞）。 ◼ 4. 培养至68～72 h（即终止培养前2～4 h），每瓶加秋 水仙素(20 μg/ml)至终浓度0.1～0.2 μg/ml，轻摇 培养瓶混匀，继续培养2～4 h。 ◼ 5. 终止培养，将培养物吹打混匀后转移到10 ml玻璃离 心管，配平，1800 rpm 离心6 min
6.低渗弃上清。加入37°℃预温的0.075mol/L氯化钾 8ml,吸管轻轻吹打混匀，37C低渗处理20min。 7.预固定加入1l新鲜配制的固定液（甲醇冰醋酸 =3:1),轻轻混匀，1800rpm离心6min。 8.固定：弃上清，加入上述新鲜固定液8l,轻轻混 匀，室温下静置固定20min。 9.弃上清，重复固定1次。 10.弃上清，根据沉淀量多少加入适量滴数新鲜固定 液，轻轻混匀，制成磨砂状悬液。 11.制片：取上述悬液1~2滴，滴至沾有冰水或干燥的 洁净载玻片上，吹散，过火，空气干燥。 12.37℃温箱放置3~4天或70°℃烘烤2h进行老化处 理，以备显带分析用
◼ 6. 低渗 弃上清。加入37℃预温的0.075 mol/L氯化钾 8 ml，吸管轻轻吹打混匀，37℃低渗处理20 min。 ◼ 7. 预固定 加入1ml 新鲜配制的固定液（甲醇:冰醋酸 =3:1），轻轻混匀，1800 rpm 离心6 min。 ◼ 8. 固定：弃上清，加入上述新鲜固定液8 ml，轻轻混 匀，室温下静置固定20 min。 ◼ 9. 弃上清，重复固定1次。 ◼ 10.弃上清，根据沉淀量多少加入适量滴数新鲜固定 液，轻轻混匀，制成磨砂状悬液。 ◼ 11.制片：取上述悬液1～2滴，滴至沾有冰水或干燥的 洁净载玻片上，吹散，过火，空气干燥。 ◼ 12.37℃温箱放置3～4天或70℃烘烤2 h进行老化处 理，以备显带分析用
(二)人类染色体的G显带 1.胰蛋白酶准备：在盛有45ml0.85%生理盐水的染缸 中加3ml0.25%胰蛋白酶溶液，调节pH值至6.8 7.2,置37℃恒温水浴锅中预温。 ■2.胰蛋白酶消化处理：将经老化处理的标本片放入胰蛋 白酶溶液中处理2~3min,不断轻摇载玻片以保证 作用均匀充分。 ■3.漂洗：迅速用0.85%生理盐水漂洗，以终止胰蛋白酶 的作用。 ■4.染色：用吉姆萨工作液染色10~15min。 ·5.冲洗干燥：用缓流自来水冲洗载玻片，空气干燥或电 吹风吹干。 6.镜检：光学显微镜下观察分析核型
【实验方法和步骤】 1、预处理：实验前3---4小时，取健康小鼠，每只 腹腔注射0．01％ 秋水仙素0．3--- 0．4ml。注意不要伤及内脏。 2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠 的头部，另一只手 拉住它的尾巴，用 力向后拉断其颈椎。处死后立即用剪 刀剪 开后腿上的皮毛，取出小鼠的股 骨，剔除上面的肌肉，洗净。 (二)人类染色体的G显带 ◼ 1.胰蛋白酶准备：在盛有45 ml 0.85%生理盐水的染缸 中加3 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，调节pH值至6.8～ 7.2，置37℃恒温水浴锅中预温。 ◼ 2.胰蛋白酶消化处理：将经老化处理的标本片放入胰蛋 白酶溶液中处理2～3 min，不断轻摇载玻片以保证 作用均匀充分。 ◼ 3.漂洗：迅速用0.85%生理盐水漂洗，以终止胰蛋白酶 的作用。 ◼ 4.染色：用吉姆萨工作液染色10～15 min。 ◼ 5.冲洗干燥：用缓流自来水冲洗载玻片，空气干燥或电 吹风吹干。 ◼ 6.镜检：光学显微镜下观察分析核型