国家自然科学基金申请书 拟采取的研究方案及可行性分析 【研究方法】 (1)酶解与植块法培养原代0B,碱性磷酸酶(ALP)显色鉴定。 (2) ELISA分析小鼠免疫活性细胞表达的Th1/Th2型细胞因子水平。 3)流式细胞术(FCM)分析DNA周期和细胞凋亡,H掺入法分析0B增殖能力。 (4)HPLC(高效液相色谱)比较骨和子宫内膜中芳香化酶( aromatase)活性。 (5)免疫化学发光法测定内分泌激素水平,DEXA测量BMD,骨和子宫内膜的组织切片形态计量 (6)实时定量RT-PCR比较ER亚型, OPG mRNA的表达; immunoblotting分析pERK1/2表达 (7)透射电镜(TEM)观察体外及骨组织中0B形态及其细胞器的变化 (8) TUNEL法原位分析骨组织中OB的凋亡;PCNA免疫荧光组织分析OB细胞增殖潜能。 (9)RNAi技术建立优势ER亚型沉默表达的hG63和HEC1-B细胞系用于解析细胞内信号转导途 【技术路线】 (1)补肾宁心方对骨和子宫的选择性作用及对0B生物学功能的影响 雌性BALB/c小鼠(12-13月龄) 正常对照假手术对照 去势手术 (7天后) 生理盐水(等体积)生理盐水/E2/补肾宁心方 取血——制备药物血清,测定内分泌 脾脏——免疫活性细胞细胞因子表达水平 子宫——称量湿重,内膜组化分析腺体改变,制备微粒体 股骨——电镜观察OB细胞器变化,制备微粒体 胫骨——提取RNA,RT-PCR分析ER亚型表达 椎骨——测酬MD,骨形态计量,原位分析细胞凋亡,及PCNA分析细胞增殖潜能 颅骨 植块法培养,观察骨片融合时间;传1代,H掺入法分析细胞增殖,FCM分析DNA周期 第8页 版本1.018.551国家自然科学基金申请书 第 8 页 版本 1.018.551 3、 拟采取的研究方案及可行性分析。 【研究方法】 （1） 酶解与植块法培养原代 OB，碱性磷酸酶（ALP）显色鉴定。 （2） ELISA 分析小鼠免疫活性细胞表达的 Th1/Th2 型细胞因子水平。 （3） 流式细胞术（FCM）分析 DNA 周期和细胞凋亡，3 H 掺入法分析 OB 增殖能力。 （4） HPLC（高效液相色谱）比较骨和子宫内膜中芳香化酶（aromatase）活性。 （5） 免疫化学发光法测定内分泌激素水平，DEXA 测量 BMD,骨和子宫内膜的组织切片形态计量。 （6） 实时定量 RT-PCR 比较 ER 亚型，OPG mRNA 的表达；immunoblotting 分析 pERK1/2 表达。 （7） 透射电镜（TEM）观察体外及骨组织中 OB 形态及其细胞器的变化。 （8） TUNEL 法原位分析骨组织中 OB 的凋亡；PCNA 免疫荧光组织分析 OB 细胞增殖潜能。 （9） RNAi 技术建立优势 ER 亚型沉默表达的 hMG63 和 HEC1-B 细胞系用于解析细胞内信号转导途 径。 【技术路线】 （1） 补肾宁心方对骨和子宫的选择性作用及对 OB 生物学功能的影响 雌性 BALB/c 小鼠（12-13 月龄） ↓ 正常对照 假手术对照 去势手术 （7 天后） ↓ ↓ 生理盐水（等体积） 生理盐水/E2/补肾宁心方 ↓ 取血——制备药物血清，测定内分泌 ↓ 脾脏——免疫活性细胞细胞因子表达水平 ↓ 子宫——称量湿重，内膜组化分析腺体改变，制备微粒体 ↓ 股骨——电镜观察 OB 细胞器变化，制备微粒体 ↓ 胫骨——提取 RNA，RT-PCR 分析 ER 亚型表达 ↓ 椎骨——测 BMD，骨形态计量，原位分析细胞凋亡，及 PCNA 分析细胞增殖潜能 ↓ 颅骨 ↓ 植块法培养，观察骨片融合时间；传 1 代，3 H 掺入法分析细胞增殖，FCM 分析 DNA 周期