活性,说明切除的肽链与活性无关,反之,切除的肽链与活性有关。 2.化学修饰法 选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引起共价结 合、氧化或还原等修饰,称之为化学修饰。酶分子中可以修饰的基团有:-SH、-0H、 咪唑基、氨基、羧基、胍基等,用作修饰的试剂很多,目前已有七十多种,但专一性 的修饰剂不多 判断方法:某一基团被修饰后,酶的活性显著下降或无活性,可初步判断该基 团与酶的活性有关;反之,与酶的活性无关 缺点:也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶分子的 正常空间结构,而导致酶活性的丧失。为排除这种可能,常在底物保护下用同一试剂 对酶作用,若不能被修饰,说明该基团确实处于活性部位;反之,底物存在下,该基 团可被同一试剂修饰,且使酶失活,在则该基团不是活性部位的基团,而是结构基团 根据修饰剂是否专一性结合藤的活性中心的特定基团,化学修饰可分为: (1)、非特异性共价共接修饰:修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合,又可 与酶的非活性部位的同一基团结合,称之为非特异性共价共价修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位,在非活性部位不存在或极少存在。判断标 准是一:酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比;二:底物或竞争性抑制剂保护下可 防止修饰剂的抑制作用。 (2)、特异性的共价修饰:修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团,使酶失活。 如:DIFP(二异丙基氟磷酸)可专一性地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸—OH而 使酶失活。DIFP一般不与蛋白质反应,也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应, 只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合 3.亲和标记法: 根据酶与底物能特异性的结合的性质,设计合成一种含反应基团的底物类似物,作 为活性部位的标记试剂,它能象底物一样进入酶的活性部位,并以其活泼的化学基团与 酶的活性基团的某些特定基团共价结合,使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为: N一对甲苯磺酰一L一苯丙氨酰乙酯或甲酯,根据此结构设计的亲和标记试剂为:N一对 甲苯磺酰一苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK) 4.X一射线衍射法: 把一纯酶的X一射线晶体衍射图谱与酶与底物反应后的X-射线图谱相比较,即可确 定酶的活性中心。 (四)酶的活性中心的一级结构 应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究发现,在酶的活性中心处 存在频率最髙的氨基酸残基是:丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨 酸和半胱氨酸。如果用冋位素标记酶的活性中心后,将酶水解,分离带标记 水解片段,对其进行一级结构测定,就可了解酶的活性中心的一级结构。 对各种蛋白水解酶进行类似的分析,功能类似的酶在一级结构上有惊人的相 似性。见下表所示 酶 氨基酸顺序 胰蛋白酶(牛 天冬.丝,半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.缬 胰凝乳蛋白酶(牛) 丝.丝.半胱.甲硫.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮 弹性蛋白酶(猪) 丝.甘.半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮- 凝血酶(牛) 天冬.丙.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.苯丙 蛋白酶(S. griseus) 苏.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.甲硫活性，说明切除的肽链与活性无关，反之，切除的肽链与活性有关。 2.化学修饰法 选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引起共价结 合、氧化或还原等修饰，称之为化学修饰。酶分子中可以修饰的基团有：-SH、-OH、 咪唑基、氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多，目前已有七十多种，但专一性 的修饰剂不多。 判断方法：某一基团被修饰后，酶的活性显著下降或无活性，可初步判断该基 团与酶的活性有关；反之，与酶的活性无关。 缺点： 也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶分子的 正常空间结构，而导致酶活性的丧失。为排除这种可能，常在底物保护下用同一试剂 对酶作用，若不能被修饰，说明该基团确实处于活性部位；反之，底物存在下，该基 团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该基团不是活性部位的基团，而是结构基团。 根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学修饰可分为： （1）、非特异性共价共接修饰：修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可 与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共价共价修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位，在非活性部位不存在或极少存在。判断标 准是一：酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比；二：底物或竞争性抑制剂保护下可 防止修饰剂的抑制作用。 （2）、特异性的共价修饰：修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶失活。 如：DIFP（二异丙基氟磷酸）可专一性地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸—OH 而 使酶失活。DIFP 一般不与蛋白质反应，也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应， 只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。 3.亲和标记法： 根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作 为活性部位的标记试剂，它能象底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与 酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为： N—对甲苯磺酰—L—苯丙氨酰乙酯或甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N—对 甲苯磺酰—苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）。 4.X—射线衍射法： 把一纯酶的 X—射线晶体衍射图谱与酶与底物反应后的 X-射线图谱相比较，即可确 定酶的活性中心。 (四)酶的活性中心的一级结构 应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究发现，在酶的活性中心处 存在频率最高的氨基酸残基是：丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨 酸和半胱氨酸。如果用同位素标记酶的活性中心后，将酶水解，分离带标记 水解片段，对其进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一级结构。 对各种蛋白水解酶进行类似的分析，功能类似的酶在一级结构上有惊人的相 似性。见下表所示： 酶 氨基酸顺序 胰蛋白酶（牛） 胰凝乳蛋白酶（牛） 弹性蛋白酶（猪） 凝血酶（牛） 蛋白酶（S.griseus） —天冬.丝,半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.缬- -丝.丝.半胱.甲硫.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮- -丝.甘.半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮- -天冬.丙.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.苯丙 -苏.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.甲硫