取出肝脏，剪成小块（去除结缔组织）尽快浸入冰冷的生理盐水(0.9%NaCI), 使组织冷却并洗去血污。 (2)将湿重约1g的肝组织放在小培养皿中，用量筒量取81预冷的 0.25mo1/L蔗糖溶液，先加少量该溶液于培养皿中，尽量剪碎肝组织后 再全部加入。 (3)剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿 中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3~5次，用 3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干 爍。 (4)将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm,离 心15分钟：缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中， 待分离线粒体用：同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥：(3)余下的 沉淀物进行下一步骤。 (5)用6m10.25mol1/L燕糖溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟 弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③， 自然干燥。 (6)晾干的以上三张涂片在95%乙醇中固定5分钟，自然晾干后再用 甲基绿一哌罗宁混合液染色20分钟，水冲洗。用吸水纸吸去多余的水分， 但在徐膜上不可吸的过干，在纯丙铜中分化2一3秒，晾干待镜俭。 分别于高倍镜下观察三张涂片，被染成亮蓝色的为细胞核。分析比较三 张涂片的结果。 2、高速离心分离提取线粒体 (1)将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后， 以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。 (2)加入0.25mo1/L蔗糖溶液1m1,用吸管吹打成悬液，以17000rDm 离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml0.25mol /L蔗糖溶液混匀成悬液（可用牙签）。 (3)取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上（分别标记④， ⑤涂片)，各滴一滴詹纳斯绿B染液盖上盖片染2-3分钟，高倍镜或油镜下 观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成亮绿色。 四、作业与思考 1,简要说明细胞分离的原理及主要先魔 2.比较一下分离细胞核时涂片①、②、③有什么不同？涂片③在你的实 验结果中纯度如何？ 3.描述一下涂片⑤所见结果。 (李永芳常正尧)14 取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快浸入冰冷的生理盐水（0.9％NaCl）， 使组织冷却并洗去血污。 （2）将湿重约 1g 的肝组织放在小培养皿中，用量筒量取 8ml 预冷的 0.25mol／L 蔗糖溶液，先加少量该溶液于培养皿中，尽量剪碎肝组织后， 再全部加入。 （3）剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿 中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨 3～5 次，用 3 层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干 燥。 （4）将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以 2500rpm，离 心 15 分钟；缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中， 待分离线粒体用；同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的 沉淀物进行下一步骤。 （5）用 6ml0.25mol/L 蔗糖溶液悬浮沉淀物，以 2500rpm 离心 15 分钟 弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③， 自然干燥。 （6）晾干的以上三张涂片在 95％乙醇中固定 5 分钟，自然晾干后再用 甲基绿一哌罗宁混合液染色 20 分钟，水冲洗。用吸水纸吸去多余的水分， 但在涂膜上不可吸的过干，在纯丙酮中分化 2～3 秒，晾干待镜俭。 分别于高倍镜下观察三张涂片，被染成亮蓝色的为细胞核。分析比较三 张涂片的结果。 2、高速离心分离提取线粒体 （1）将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后， 以 17000rpm 离心 20 分钟，弃上清，留取沉淀物。 （2）加入 0．25mol／L 蔗糖溶液 lml，用吸管吹打成悬液，以 17000rpm 离心 20 分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入 0.1ml 0．25mol ／L 蔗糖溶液混匀成悬液(可用牙签)。 （3）取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、 ⑤涂片)，各滴一滴詹纳斯绿 B 染液盖上盖片染 2-3 分钟，高倍镜或油镜下 观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿 B 染成亮绿色。 四、作业与思考 1．简要说明细胞分离的原理及主要步骤。 2．比较一下分离细胞核时涂片①、②、③有什么不同?涂片③在你的实 验结果中纯度如何？ 3．描述一下涂片⑤所见结果。 （李永芳 常正尧）