第二泳道分别为VSVXN2和VSV△MT,G蛋白大小为57kDa,N/P蛋白大小为47kDa,M蛋白只 比突变后的M蛋白多一个氨基酸大小基本一样，都约为26kDa。而阴性对照，没有接病毒的 vero细胞裂解液没有任何条带。 kDa 70 G 55 +N/P 40 35 M,M 25 3 图5.western-blotting鉴定VSV△MT病毒1.VSVXN2:2.VSV△MT:3.未接病毒的上清 Fig 5.Western-blotting identification of VSVAMT.Line 1 Vero cell lysate infected with VSVXN2.Line 2.Vero cell lysate infected with VSV-MT;Line 3.Mock infection 4讨论 发展具有安全、高效、多价、应用方便等特点的理想疫苗，是人们所希望的。而基于致 弱病毒的活载体疫苗是一个很好的方向，因为病毒载体表达的外源抗原可高效和全面地激发 机体免疫应答。VSV是一种非常有前景的病毒载体，具有很多的优点，但是其具有神经毒性， 从而在临床利用方面存在一定的局限性，因此，有必要对VSV加以改进，消除其致病性。改 造病毒从而达到弱化的方法有很多，其中包括：(1)自然弱化的病毒株，如麻疹病毒的 Edamonson株：(2)经非天然宿主动物或细胞反复传代致弱，如痘苗病毒安卡拉株(MWA) 是野毒鸡胚成纤维细胞(CE℉)传代570次以上得到的高度致弱毒株：(3)利用基因工程技 术对野生型病毒进行人工弱化正在成为趋势，其主要方法是：①利用特定细胞中活化的启动 子，如在肿瘤细胞中具有高活性的端粒酶基因启动子(telemerasepromoter)去控制病毒复 制必需基因，使得病毒只能在特定细胞（如肿瘤细胞）中复制，而在正常细胞中不复制，从 而达到减毒目的②假型化改造(pseudotyping),即改变病毒天然嗜性，如利用VSV病毒 载体表达Ebola病毒囊膜蛋白开发的人用疫苗：③利用组织特异性表达的MicroRNA分子减 低病毒的毒性。MicroRNA是一类具有组织表达特异性的转录后调控分子，不同的MicroRNA 在不同组织中的分布存在差异，基于此，Kel1y等利用肌肉组织特异性miR133a识别序列开 发的柯萨奇病毒载体，去除了野生型病毒对肌肉组织的毒性a。本研究通过PCR技术和反向 遗传技术构建重组病毒，对VSV毒力基因M进行定点突变，分别对M基因的第51为氨基酸 进行了缺失和第221位和226位氨基酸进行了突变，经RT-PCR和western鉴定，获得了水 泡性口炎病毒的基质蛋白基因三位点发生突变的新水泡性口炎病毒，希望通过对其机制蛋白 的突变降低其致病性，从而可以作为一种安全性较高的病毒载体。至于其致病性是否减弱， 还需相关的动物实验，包括模式动物和本体动物两个方面，因此，后续工作将在VSV在模式 动物上，最终在本体动物（如牛和猪）上对VSV△MT病毒的安全性和有效性进行研究。 5结论 作者利用PCR技术和病毒挽救技术，经过RT-PCR和western--blotting技术鉴定，成功构第二泳道分别为 VSVXN2 和 VSVΔMT，G 蛋白大小为 57kDa，N/P 蛋白大小为 47kDa，M 蛋白只 比突变后的 M 蛋白多一个氨基酸大小基本一样，都约为 26kDa。而阴性对照，没有接病毒的 vero 细胞裂解液没有任何条带。 图 5.western-blotting 鉴定 VSVΔMT 病毒 1.VSVXN2；2.VSVΔMT；3.未接病毒的上清 Fig 5. Western-blotting identification of VSVΔMT. Line 1 Vero cell lysate infected with VSVXN2. Line 2. Vero cell lysate infected with VSV-MT; Line 3. Mock infection 4 讨论 发展具有安全、高效、多价、应用方便等特点的理想疫苗，是人们所希望的。而基于致 弱病毒的活载体疫苗是一个很好的方向，因为病毒载体表达的外源抗原可高效和全面地激发 机体免疫应答。VSV 是一种非常有前景的病毒载体，具有很多的优点，但是其具有神经毒性， 从而在临床利用方面存在一定的局限性，因此，有必要对 VSV 加以改进，消除其致病性。改 造病毒从而达到弱化的方法有很多，其中包括：（1）自然弱化的病毒株，如麻疹病毒的 Edamonson 株；（2）经非天然宿主动物或细胞反复传代致弱，如痘苗病毒安卡拉株（MVA） 是野毒鸡胚成纤维细胞（CEF）传代 570 次以上得到的高度致弱毒株；（3）利用基因工程技 术对野生型病毒进行人工弱化正在成为趋势，其主要方法是：①利用特定细胞中活化的启动 子，如在肿瘤细胞中具有高活性的端粒酶基因启动子（telemerasepromoter）去控制病毒复 制必需基因，使得病毒只能在特定细胞（如肿瘤细胞）中复制，而在正常细胞中不复制，从 而达到减毒目的 [14]②假型化改造（pseudotyping），即改变病毒天然嗜性，如利用 VSV 病毒 载体表达Ebola病毒囊膜蛋白开发的人用疫苗 [15] ;③利用组织特异性表达的MicroRNA分子减 低病毒的毒性。MicroRNA 是一类具有组织表达特异性的转录后调控分子，不同的 MicroRNA 在不同组织中的分布存在差异，基于此，Kelly 等利用肌肉组织特异性 miR133a 识别序列开 发的柯萨奇病毒载体，去除了野生型病毒对肌肉组织的毒性 [16]。本研究通过 PCR 技术和反向 遗传技术构建重组病毒，对 VSV 毒力基因 M 进行定点突变，分别对 M 基因的第 51 为氨基酸 进行了缺失和第 221 位和 226 位氨基酸进行了突变，经 RT-PCR 和 western 鉴定，获得了水 泡性口炎病毒的基质蛋白基因三位点发生突变的新水泡性口炎病毒，希望通过对其机制蛋白 的突变降低其致病性，从而可以作为一种安全性较高的病毒载体。至于其致病性是否减弱， 还需相关的动物实验，包括模式动物和本体动物两个方面，因此，后续工作将在 VSV 在模式 动物上，最终在本体动物（如牛和猪）上对 VSVΔMT 病毒的安全性和有效性进行研究。 5 结论 作者利用PCR技术和病毒挽救技术，经过RT-PCR和western-blotting技术鉴定，成功构