Matrix蛋白三位点突变的重组水泡性口炎病毒的构建 参与学生：宋时华学院：农业与生物学院学号：5111509083 指导教师：孙涛学院：农业与生物学院 摘要 重组水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)是一种具有良好应用的前 景的病毒载体，可应用于制备疫苗和治疗肿瘤，但该载体仍存在安全性问题，高剂量注射实 验动物可导致产生神经毒性。因此，作者针对VSV重要毒力因子，对水泡性口炎病毒的Matrix 蛋白进行了三位点突变，敲出了原来的Matrix蛋白的第51位氨基酸，将Matrix蛋白的第221 位和226位氨基酸（缬氨酸和丝氨酸）进行了突变，分别突变为苯丙氨酸和精氨酸，得到了 Matrix蛋白发生三位点突变的水泡性口炎病毒(VSV△MT),希望能够降低水泡性口炎病毒的 致病性。 关键词：水泡性口炎病毒，VSV△MT,M蛋白 ABSTRACT Recombinant Vesiclar stomatitis virus is an ideal viral vector for vaccine and virotherapy, however,there still exists toxicities in VSV vector.Animals exhibited neurotoxicity when injected with high dose of VSV.Therefore recombinant VSV aiming at its virulent factors was developed, which included deletion of methionine 51 in matrix protein and mutation of valine 221 to phenylalanine and serine 226 to arginine.Then we gained the novel VSV that is VSVAMT which maybe be decreased the pathogenesis. KEY WORDS:VSV,VSVAMT,Matrix protein 正文 1绪论 水泡性口炎(Vesicular stomatitis,.VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)引起的一种急性高度接触性传染病，马、牛、猪等动物较易感，绵羊和山羊也 可感染。临床上以舌、唇、口腔粘膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要特征。水泡 性口炎在临床症状上很难与口蹄疫(FMD)、猪水疱病(SV)、猪水疱性疹(VES)等传染性 疾病区别开来。在我国，水泡性口炎为外来动物病，还未有大规模爆发的报道，国家进出境 动物检疫对象中将其列为二类疫病。但随着我国加入WTO,动物及动物产品的国际贸易量增 加，外来动物病传入我国的风险逐渐加大。目前，国际上还无预防VSV的有效疫苗，国内也 还未见相关研究的报道，因此，亟需有效的技术和有效疫苗储备以应对可能的挑战。 VSV是一种属于弹状病毒科，是一种具囊膜的虫媒病毒，其基因组是一条单链负义RNA 分子，长度约为11kb,由5个基因组成，分别编码病毒的核衣壳蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、 基质蛋白(matrix,M)、囊膜蛋白(G)和病毒RNA复制酶(L)口。利用重组病毒载体在体 内表达目的抗原，并且能模拟病毒的自然感染，因此能够激发有效地激发机体的综合免疫， 其中包括细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫，VSV是一个很有前景的病毒载体，不仅可以本身作 为预防水泡性口炎的疫苗，还具有本身的一些特点，其中包括：(1)对人无致病性，比
Matrix蛋白三位点突变的重组水泡性口炎病毒的构建 参与学生：宋时华 学院：农业与生物学院 学号：5111509083 指导教师：孙涛 学院：农业与生物学院 摘要 重组水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV）是一种具有良好应用的前 景的病毒载体，可应用于制备疫苗和治疗肿瘤，但该载体仍存在安全性问题，高剂量注射实 验动物可导致产生神经毒性。因此，作者针对VSV重要毒力因子，对水泡性口炎病毒的Matrix 蛋白进行了三位点突变，敲出了原来的Matrix蛋白的第51位氨基酸，将Matrix蛋白的第221 位和226位氨基酸（缬氨酸和丝氨酸）进行了突变，分别突变为苯丙氨酸和精氨酸，得到了 Matrix蛋白发生三位点突变的水泡性口炎病毒（VSVΔMT）,希望能够降低水泡性口炎病毒的 致病性。 关键词：水泡性口炎病毒，VSVΔMT，M蛋白 ABSTRACT Recombinant Vesiclar stomatitis virus is an ideal viral vector for vaccine and virotherapy, however, there still exists toxicities in VSV vector. Animals exhibited neurotoxicity when injected with high dose of VSV. Therefore recombinant VSV aiming at its virulent factors was developed, which included deletion of methionine 51 in matrix protein and mutation of valine 221 to phenylalanine and serine 226 to arginine. Then we gained the novel VSV that is VSVΔMT which maybe be decreased the pathogenesis. KEY WORDS：VSV，VSVΔMT，Matrix protein 正文 1 绪论 水泡性口炎（Vesicular stomatitis, VS）是由水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV）引起的一种急性高度接触性传染病，马、牛、猪等动物较易感，绵羊和山羊也 可感染。临床上以舌、唇、口腔粘膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要特征 [1,2]。水泡 性口炎在临床症状上很难与口蹄疫（FMD）、猪水疱病（SV）、猪水疱性疹（VES）等传染性 疾病区别开来。在我国，水泡性口炎为外来动物病，还未有大规模爆发的报道, 国家进出境 动物检疫对象中将其列为二类疫病。但随着我国加入WTO，动物及动物产品的国际贸易量增 加，外来动物病传入我国的风险逐渐加大。目前，国际上还无预防VSV的有效疫苗，国内也 还未见相关研究的报道，因此，亟需有效的技术和有效疫苗储备以应对可能的挑战。 VSV是一种属于弹状病毒科，是一种具囊膜的虫媒病毒，其基因组是一条单链负义RNA 分子，长度约为11kb, 由5个基因组成，分别编码病毒的核衣壳蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、 基质蛋白（matrix, M）、囊膜蛋白（G）和病毒RNA复制酶（L） [1]。利用重组病毒载体在体 内表达目的抗原，并且能模拟病毒的自然感染，因此能够激发有效地激发机体的综合免疫， 其中包括细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫，VSV是一个很有前景的病毒载体,不仅可以本身作 为预防水泡性口炎的疫苗 [3]，还具有本身的一些特点，其中包括：（1）对人无致病性，比
较安全：(2)载体基因组中可插入多个外源基因同时进行高效表达，并可激发机体产生全 面的免疫保护力，尤其是细胞免疫和黏膜免疫：(3)繁殖速度快，易于大规模培养。然 而VSV中的M蛋白具有阻止宿主细胞的mRNA从细胞核转运至细胞质的功能，从而抑制细胞产生 I型干扰素的功能，这样就能让其在宿主细胞中扩增，对宿主产生毒性，大剂量注射VSV后， 实验动物会出现神经毒性症状，如后置麻痹ao。M蛋白是VSV的重要毒力因子，本实验就 是围绕VSV的M蛋白对病毒进行改造。我们主要对病毒的M蛋白的第51位氨基酸（甲硫氨酸） 进行了敲除，对第221位和226位氨基酸（缬氨酸和丝氨酸）进行了突变，分别突变为苯丙氨 酸和精氨酸。通过对VSV的三个位点的突变以期降低致病性。 图1.VSV电镜图片 Fig 1.VSV stereoscan photograph 2材料与方法 2.1细胞与试剂 BHK21、Vero、细胞由本实验室保存：MluI和XhoI限制性内切酶购自NEB公司，细胞 培养用的DMEM购自Thermo公司，胎牛血清购自Gbico公司，细胞转染脂质体 Lipofectamine?2OO0购自Invitrogen,PFU高保真酶、T4连接酶和逆转录试剂盒为fermentas 公司生产，PVDF膜购自北京鼎国昌盛生物公司。 VSV挽救所需质粒pBS-N、pBS-P、pBS-L及pVSV△M51和VSVinia.基因全长序列的质粒 PVSVXN2由本实验室保存。 2.2pVSV△MT质粒构建 pVSV△MT质粒构建以质粒pVSV△M51为模板，设计两对引物，利用PCR分别扩增得到 两段DAN片段。其中N端片段带入第51氨基酸（甲硫氨酸）缺失，我们将N端片段下游引 物中带入M蛋白第221为氨基酸（缬氨酸）和第226氨基酸（丝氨酸）点突变，分别突变为 苯丙氨酸和精氨酸：在C端片段，我们在上游引物中同样带入M蛋白的第221为氨基酸（缬 氨酸)和第226氨基酸（丝氨酸）点突变，N端片段的下游引物和C端的上游引物完全互补 配对，其中 N端片段的下游引物： 5'-GGGTCCTGGATTCTATCCGCCACTTCAAATG-3',而根据对称原则，添加相应的上游引物，其 C端的上游引物：5'-CATTTGAAGTGGCGGATAGAATCCAGGACCC-3'。利用重叠PCR扩增得到含有第 51位氨基酸缺失、第221氨基酸（缬氨酸）突变为苯丙氨酸和第226氨基酸（丝氨酸）突 变为精氨酸的三个氨基酸位点发生突变的M蛋白DNA序列(MT)。其中N端片段的上有引物 带有MIuI酶切位点，C端片段的下游引物带有XhoI酶切位点。得到的MT片段和同样M 蛋白位置含有M1uI和XhoI酶切位点的质粒pVSV△M51,再经T4连接酶连接得到M蛋白 含有三位点突变的质粒(pVSV△MT)。如图2所示
较安全；（2）载体基因组中可插入多个外源基因同时进行高效表达，并可激发机体产生全 面的免疫保护力，尤其是细胞免疫和黏膜免疫 [4] ；（3）繁殖速度快，易于大规模培养。然 而VSV中的M蛋白具有阻止宿主细胞的mRNA从细胞核转运至细胞质的功能，从而抑制细胞产生 I型干扰素的功能 [5-8]，这样就能让其在宿主细胞中扩增，对宿主产生毒性,大剂量注射VSV后， 实验动物会出现神经毒性症状，如后置麻痹 [9,10]。M蛋白是VSV的重要毒力因子 [11]，本实验就 是围绕VSV的M 蛋白对病毒进行改造。我们主要对病毒的M蛋白的第51位氨基酸（甲硫氨酸） 进行了敲除，对第221位和226位氨基酸（缬氨酸和丝氨酸）进行了突变，分别突变为苯丙氨 酸和精氨酸。通过对VSV的三个位点的突变以期降低致病性。 图 1. VSV 电镜图片 Fig 1.VSV stereoscan photograph 2 材料与方法 2.1 细胞与试剂 BHK21、Vero、细胞由本实验室保存；MluI 和 XhoI 限制性内切酶购自 NEB 公司，细胞 培 养 用 的 DMEM 购 自 Thermo 公 司 ， 胎 牛 血 清 购 自 Gbico 公 司 ， 细 胞 转 染 脂 质 体 Lipofectamine2000 购自 Invitrogen，PFU 高保真酶、T4 连接酶和逆转录试剂盒为 fermentas 公司生产，PVDF 膜购自北京鼎国昌盛生物公司。 VSV 挽救所需质粒 pBS-N、pBS-P、pBS-L 及 pVSVΔM51 和 VSVindiana基因全长序列的质粒 pVSVXN2 由本实验室保存。 2.2 pVSVΔMT 质粒构建 pVSVΔMT 质粒构建以质粒 pVSVΔM51 为模板，设计两对引物， 利用 PCR 分别扩增得到 两段 DAN 片段。其中 N 端片段带入第 51 氨基酸（甲硫氨酸）缺失，我们将 N 端片段下游引 物中带入 M 蛋白第 221 为氨基酸（缬氨酸）和第 226 氨基酸（丝氨酸）点突变，分别突变为 苯丙氨酸和精氨酸；在 C 端片段,我们在上游引物中同样带入 M 蛋白的第 221 为氨基酸（缬 氨酸）和第 226 氨基酸（丝氨酸）点突变,N 端片段的下游引物和 C 端的上游引物完全互补 配 对 ， 其 中 N 端 片 段 的 下 游 引 物 ： 5'-GGGTCCTGGATTCTATCCGCCACTTCAAATG-3'，而根据对称原则，添加相应的上游引物，其 C 端的上游引物:5'-CATTTGAAGTGGCGGATAGAATCCAGGACCC-3'。利用重叠 PCR 扩增得到含有第 51 位氨基酸缺失、第 221 氨基酸（缬氨酸）突变为苯丙氨酸和第 226 氨基酸（丝氨酸）突 变为精氨酸的三个氨基酸位点发生突变的 M 蛋白 DNA 序列（MT）。其中 N 端片段的上有引物 带有 Mlu I 酶切位点，C 端片段的下游引物带有 Xho I 酶切位点。得到的 MT 片段和同样 M 蛋白位置含有 Mlu I 和 Xho I 酶切位点的质粒 pVSVΔM51，再经 T4 连接酶连接得到 M 蛋白 含有三位点突变的质粒（pVSVΔMT）。如图 2 所示
G L MT G L EM(51)D.…V(221)..S(226) ED..F(221)..R(226) 图2.野生型VSV和VSV△MT基因组结构图.N:核衣壳蛋白，P:磷酸化蛋白，M:基质蛋 白，L:RNA复制酶。VSV△MT基质蛋白的第51位甲硫氨酸被敲除，第221位氨基酸一缬氨酸 突变为苯丙氨酸，第226位氨基酸一丝氨酸突变为精氨酸。 Fig 2.Genomic structure of wild-type VSV and VSVAM51.N:Nucleoprotein,P: Phosphoprotein,M:Matrix protein,L:RNA polymerase.Methionine 51 in VSV matrix protein was deleted. 2.3 Matrix蛋白三位点突变的VSV(VSV△MT)病毒的构建 按Schnell等所述方法进行VSV△MT病毒挽救。用表达T,RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3感 染BHK-21细胞，接种量为MOI=5,孵育细胞一小时，同时制备质粒转染混合液，其中包括质 粒pBS-N、pBS-P、pBS-L及pVSV△MT,转染试剂Lipofectamine?2OO0加入opti-MEM培养基稀释， 放置5min,再将质粒混合液和转染试剂混合后室温放置25min。然后去除痘病毒悬液，加入 转染试剂与质粒混合液孵育48h后吸取上清，用0.22μm的滤膜滤去痘病毒，将滤液加入到正 常BHK-21细胞中，观察细胞病变情况，如果细胞出现病变情况，则收集上清，进行病毒鉴定。 2.4VSV△MT病毒的鉴定 2.4.1通过RT-PCR对VSV△MT病毒进行验证 取上述收集的上清0.25ml,加入0.75ml的trizolLS,.混匀，室温放置5min,再加入 0.2ml氯仿，剧烈震荡15s,放置3min,4℃12000rpm离心15min,取上层水相。1：1体积 加入异丙醇沉淀水相中的RNA,放置10min,4℃12000rpm离心10min,去上清液，得RNA 沉淀。再加入75%的乙醇重悬RNA沉淀，4℃12000rpm离心5min,去除上清，收集RNA沉淀。 再Fermentas公司逆转录试剂盒和VSV△MT的M基因下游引物进行RT-PCR,再以RT-PCR产 物为模板进行PCR得到△MT DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳测定大小后，再送上海杰李生物 技术公司进行测序，鉴定是否为三位点突变的水泡性口炎病毒。 2.4.2VSV△MT病毒的western-blotting鉴定 将经空斑纯化后的VSV△MT病毒24h后的BK-21细胞收集起来，10000rpm离心10min 收集上清，再将上清用Hitachi超速离心机30000rpm离心30min,收集病毒，用PBS重悬 病毒，再用蛋白上样缓冲液处理，然后进行1O%SDS-PAGE凝胶电泳，再将蛋白转移至PVDF 膜，用5%的脱脂奶粉封闭两个小时，封闭完成后，用PBST洗涤三次，每次10mi,然后在4℃ 下一抗按1：1000稀释度（感染VS的猪血清）孵育过夜，PBST洗涤三次，每次10min,再 进行二抗孵育，二抗为美国sigma公司生产的兔抗猪，稀释度为1：20000。PBST洗涤三次后， 用ECL试剂盒进行显色，压片，检测VSV△MT目的蛋白。 3结果 3.1VSV△MT病毒的构建及鉴定
图 2. 野生型 VSV 和 VSV ΔMT 基因组结构图.N:核衣壳蛋白，P:磷酸化蛋白，M:基质蛋 白，L:RNA 复制酶。VSV ΔMT 基质蛋白的第 51 位甲硫氨酸被敲除,第 221 位氨基酸—缬氨酸 突变为苯丙氨酸，第 226 位氨基酸—丝氨酸突变为精氨酸。 Fig 2. Genomic structure of wild-type VSV and VSVΔM51. N: Nucleoprotein, P: Phosphoprotein, M: Matrix protein, L: RNA polymerase. Methionine 51 in VSV matrix protein was deleted. 2.3 Matrix 蛋白三位点突变的 VSV（VSVΔMT）病毒的构建 按Schnell等所述方法进行VSVΔMT病毒挽救 [12]。用表达T7RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3感 染BHK-21细胞，接种量为MOI=5，孵育细胞一小时，同时制备质粒转染混合液，其中包括质 粒pBS-N、pBS-P、pBS-L及pVSVΔMT，转染试剂Lipofectamine2000加入opti-MEM培养基稀释， 放置5min，再将质粒混合液和转染试剂混合后室温放置25min。然后去除痘病毒悬液，加入 转染试剂与质粒混合液孵育48h后吸取上清，用0.22μm的滤膜滤去痘病毒，将滤液加入到正 常BHK-21细胞中，观察细胞病变情况，如果细胞出现病变情况，则收集上清，进行病毒鉴定。 2.4 VSVΔMT病毒的鉴定 2.4.1通过RT-PCR对VSVΔMT病毒进行验证 取上述收集的上清 0.25ml，加入 0.75ml 的 trizolLS, 混匀，室温放置 5min ，再加入 0.2ml 氯仿，剧烈震荡 15s，放置 3min，4℃12000rpm 离心 15min，取上层水相。1：1 体积 加入异丙醇沉淀水相中的 RNA，放置 10min，4℃12000rpm 离心 10min，去上清液，得 RNA 沉淀。再加入 75%的乙醇重悬 RNA 沉淀，4℃12000rpm 离心 5min，去除上清，收集 RNA 沉淀。 再 Fermentas 公司逆转录试剂盒和 VSVΔMT 的 M 基因下游引物进行 RT-PCR,再以 RT-PCR 产 物为模板进行 PCR 得到ΔMT DNA 片段，经琼脂糖凝胶电泳测定大小后，再送上海杰李生物 技术公司进行测序，鉴定是否为三位点突变的水泡性口炎病毒。 2.4.2 VSVΔMT 病毒的 western-blotting 鉴定 将经空斑纯化后的 VSVΔMT 病毒 24h 后的 BHK-21 细胞收集起来，10000rpm 离心 10min 收集上清，再将上清用 Hitachi 超速离心机 30000rpm 离心 30min，收集病毒，用 PBS 重悬 病毒，再用蛋白上样缓冲液处理，然后进行 10%SDS-PAGE 凝胶电泳，再将蛋白转移至 PVDF 膜，用 5%的脱脂奶粉封闭两个小时,封闭完成后，用 PBST 洗涤三次，每次 10min，然后在 4℃ 下一抗按 1:1000 稀释度（感染 VSV 的猪血清）孵育过夜，PBST 洗涤三次，每次 10min，再 进行二抗孵育，二抗为美国 sigma 公司生产的兔抗猪，稀释度为 1:20000。PBST 洗涤三次后， 用 ECL 试剂盒进行显色，压片，检测 VSVΔMT 目的蛋白。 3 结果 3.1 VSVΔMT 病毒的构建及鉴定
3.1.1VSV△MT病毒的RT-PCR鉴定 通过病毒挽救技术得到VSV△MT病毒后，将病毒用冻存管收集起来。然后进行基因组 RNA抽提，再进行逆转录，将逆转录出来的cDNA用针对VSV△MT病毒的M蛋白基因序列设 计的引物进行PCR,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图2所示在100Obp左右处有条带，分 子量与预期大小一致，即包括了M基因和部分P基因。再将PCR产物进行测序，如图所示， 第51为氨基酸发生缺失和第221位氨基酸及226位氨基酸发生突变（分别由缬氨酸突变为 苯丙氨酸和丝氨酸突变为精氨酸)。 7kbp 4kbp 2kbp 1kbD 750bp_ 500bp。 250bp 图3.VSV△MT病毒M基因PCR扩增产物琼脂糖电泳1.DNA Marker:2.扩增VSVM基因 Fig 3.Electrophoresis of PCR product of VSVAMT M Lanel.DNA Marker:Lane2.VSV Mgene product ATGAGTTCCTTAAAGAAGATTCTCGGTCTGAAGGGGAAAGGTAAGAAATCTAAGAAATTAGGGATCGCACCACCCCCTTATGAAGAGGACACTAGCATGG 古g十6中古6。书，中 AGTATGCTCCGAGCGCICCAATTGACAAATCCTATTTTGGAGTTGACGAGGACACCFATGATCCGAATCAATTAAGATATGAGAAATTCITCITTACAGT GACGAGATGGACAC E￥A P S A P1 D K S Y F G V +十+十十++ GAAAATGACGOTTAGATCTAATCGTCCGTZCAGAACATACTCAGATGTGGCAGCCGCTGTATCCCATTGGGATCACATGTACATCGGAATGGCAGGGAAA COTCCCTTCTACAAAATCTTGGCTTTITTGGGTTCTTCTAATCTAAAGGCCACTCCAGCQOTATTGGCAGATCAAGGTCAACCAGAOTATCACGCTCACT 图4.VSV△MT病毒M蛋白基因RT-PCR产物测序结果 Fig 4.sequencing result of product of RT-PCR of VSVAMT M 3.1.2VSV△MT病毒的western-blotting鉴定 经RT-PCR鉴定正确后，纯化后的病毒经超速离心浓缩后，将病毒制蛋白样，以感染VSV 的猪血清作为一抗按文献所述方法a进行western--blotting鉴定。如图所示，第一泳道和
3.1.1 VSVΔMT 病毒的 RT-PCR 鉴定 通过病毒挽救技术得到 VSVΔMT 病毒后，将病毒用冻存管收集起来。然后进行基因组 RNA 抽提，再进行逆转录，将逆转录出来的 cDNA 用针对 VSVΔMT 病毒的 M 蛋白基因序列设 计的引物进行 PCR,PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图 2 所示在 1000bp 左右处有条带，分 子量与预期大小一致，即包括了 M 基因和部分 P 基因。再将 PCR 产物进行测序，如图所示， 第 51 为氨基酸发生缺失和第 221 位氨基酸及 226 位氨基酸发生突变（分别由缬氨酸突变为 苯丙氨酸和丝氨酸突变为精氨酸）。 图 3. VSVΔMT 病毒 M 基因 PCR 扩增产物琼脂糖电泳 1.DNA Marker；2.扩增 VSV M 基因 Fig 3. Electrophoresis of PCR product of VSVΔMT M Lane1. DNA Marker；Lane2. VSV M gene product 图 4. VSVΔMT 病毒 M 蛋白基因 RT-PCR 产物测序结果. Fig 4. sequencing result of product of RT-PCR of VSVΔMT M 3.1.2 VSVΔMT 病毒的 western-blotting 鉴定 经 RT-PCR 鉴定正确后，纯化后的病毒经超速离心浓缩后，将病毒制蛋白样，以感染 VSV 的猪血清作为一抗按文献所述方法 [13]进行 western-blotting 鉴定。如图所示，第一泳道和
第二泳道分别为VSVXN2和VSV△MT,G蛋白大小为57kDa,N/P蛋白大小为47kDa,M蛋白只 比突变后的M蛋白多一个氨基酸大小基本一样，都约为26kDa。而阴性对照，没有接病毒的 vero细胞裂解液没有任何条带。 kDa 70 G 55 +N/P 40 35 M,M 25 3 图5.western-blotting鉴定VSV△MT病毒1.VSVXN2:2.VSV△MT:3.未接病毒的上清 Fig 5.Western-blotting identification of VSVAMT.Line 1 Vero cell lysate infected with VSVXN2.Line 2.Vero cell lysate infected with VSV-MT;Line 3.Mock infection 4讨论 发展具有安全、高效、多价、应用方便等特点的理想疫苗，是人们所希望的。而基于致 弱病毒的活载体疫苗是一个很好的方向，因为病毒载体表达的外源抗原可高效和全面地激发 机体免疫应答。VSV是一种非常有前景的病毒载体，具有很多的优点，但是其具有神经毒性， 从而在临床利用方面存在一定的局限性，因此，有必要对VSV加以改进，消除其致病性。改 造病毒从而达到弱化的方法有很多，其中包括：(1)自然弱化的病毒株，如麻疹病毒的 Edamonson株：(2)经非天然宿主动物或细胞反复传代致弱，如痘苗病毒安卡拉株(MWA) 是野毒鸡胚成纤维细胞(CE℉)传代570次以上得到的高度致弱毒株：(3)利用基因工程技 术对野生型病毒进行人工弱化正在成为趋势，其主要方法是：①利用特定细胞中活化的启动 子，如在肿瘤细胞中具有高活性的端粒酶基因启动子(telemerasepromoter)去控制病毒复 制必需基因，使得病毒只能在特定细胞（如肿瘤细胞）中复制，而在正常细胞中不复制，从 而达到减毒目的②假型化改造(pseudotyping),即改变病毒天然嗜性，如利用VSV病毒 载体表达Ebola病毒囊膜蛋白开发的人用疫苗：③利用组织特异性表达的MicroRNA分子减 低病毒的毒性。MicroRNA是一类具有组织表达特异性的转录后调控分子，不同的MicroRNA 在不同组织中的分布存在差异，基于此，Kel1y等利用肌肉组织特异性miR133a识别序列开 发的柯萨奇病毒载体，去除了野生型病毒对肌肉组织的毒性a。本研究通过PCR技术和反向 遗传技术构建重组病毒，对VSV毒力基因M进行定点突变，分别对M基因的第51为氨基酸 进行了缺失和第221位和226位氨基酸进行了突变，经RT-PCR和western鉴定，获得了水 泡性口炎病毒的基质蛋白基因三位点发生突变的新水泡性口炎病毒，希望通过对其机制蛋白 的突变降低其致病性，从而可以作为一种安全性较高的病毒载体。至于其致病性是否减弱， 还需相关的动物实验，包括模式动物和本体动物两个方面，因此，后续工作将在VSV在模式 动物上，最终在本体动物（如牛和猪）上对VSV△MT病毒的安全性和有效性进行研究。 5结论 作者利用PCR技术和病毒挽救技术，经过RT-PCR和western--blotting技术鉴定，成功构
第二泳道分别为 VSVXN2 和 VSVΔMT，G 蛋白大小为 57kDa，N/P 蛋白大小为 47kDa，M 蛋白只 比突变后的 M 蛋白多一个氨基酸大小基本一样，都约为 26kDa。而阴性对照，没有接病毒的 vero 细胞裂解液没有任何条带。 图 5.western-blotting 鉴定 VSVΔMT 病毒 1.VSVXN2；2.VSVΔMT；3.未接病毒的上清 Fig 5. Western-blotting identification of VSVΔMT. Line 1 Vero cell lysate infected with VSVXN2. Line 2. Vero cell lysate infected with VSV-MT; Line 3. Mock infection 4 讨论 发展具有安全、高效、多价、应用方便等特点的理想疫苗，是人们所希望的。而基于致 弱病毒的活载体疫苗是一个很好的方向，因为病毒载体表达的外源抗原可高效和全面地激发 机体免疫应答。VSV 是一种非常有前景的病毒载体，具有很多的优点，但是其具有神经毒性， 从而在临床利用方面存在一定的局限性，因此，有必要对 VSV 加以改进，消除其致病性。改 造病毒从而达到弱化的方法有很多，其中包括：（1）自然弱化的病毒株，如麻疹病毒的 Edamonson 株；（2）经非天然宿主动物或细胞反复传代致弱，如痘苗病毒安卡拉株（MVA） 是野毒鸡胚成纤维细胞（CEF）传代 570 次以上得到的高度致弱毒株；（3）利用基因工程技 术对野生型病毒进行人工弱化正在成为趋势，其主要方法是：①利用特定细胞中活化的启动 子，如在肿瘤细胞中具有高活性的端粒酶基因启动子（telemerasepromoter）去控制病毒复 制必需基因，使得病毒只能在特定细胞（如肿瘤细胞）中复制，而在正常细胞中不复制，从 而达到减毒目的 [14]②假型化改造（pseudotyping），即改变病毒天然嗜性，如利用 VSV 病毒 载体表达Ebola病毒囊膜蛋白开发的人用疫苗 [15] ;③利用组织特异性表达的MicroRNA分子减 低病毒的毒性。MicroRNA 是一类具有组织表达特异性的转录后调控分子，不同的 MicroRNA 在不同组织中的分布存在差异，基于此，Kelly 等利用肌肉组织特异性 miR133a 识别序列开 发的柯萨奇病毒载体，去除了野生型病毒对肌肉组织的毒性 [16]。本研究通过 PCR 技术和反向 遗传技术构建重组病毒，对 VSV 毒力基因 M 进行定点突变，分别对 M 基因的第 51 为氨基酸 进行了缺失和第 221 位和 226 位氨基酸进行了突变，经 RT-PCR 和 western 鉴定，获得了水 泡性口炎病毒的基质蛋白基因三位点发生突变的新水泡性口炎病毒，希望通过对其机制蛋白 的突变降低其致病性，从而可以作为一种安全性较高的病毒载体。至于其致病性是否减弱， 还需相关的动物实验，包括模式动物和本体动物两个方面，因此，后续工作将在 VSV 在模式 动物上，最终在本体动物（如牛和猪）上对 VSVΔMT 病毒的安全性和有效性进行研究。 5 结论 作者利用PCR技术和病毒挽救技术，经过RT-PCR和western-blotting技术鉴定，成功构
建了水泡性口炎病毒的M基因的第51位氨基酸缺失和第221位和226位氨基酸进行了突变的重 组水泡性口炎病毒(VSV△MT),为后面的该病毒在本体动物上有效性和安全性研究提供了 基础和前提。 参考文献 [1].Rose JK,Whitt MA.Rhabdoviridae:the viruses and their replication.In:Knipe DM,Howley PM editors.Fields Virology,vol.1 Philadelphia:Lipopincot willianms &Wilkins,2001, p.1221-1244. [2]Bridges VE,McCluskey BJ,Salman MD,et al.Review of the 1995 vesicular stomatitis outbreak in the western United States[J].J Am Vet Med Assoc.1997,211(5):556-60. [3]Martinez I,Barrera JC,Rodriguez LL,et al.Recombinant vesicular stomatitis(Indiana)virus expressing New Jersey and Indiana glycoproteins induces neutralizing antibodies to each serotype in swine,a natural host.Vaccine 2004:22(29-30):4035-43. [4]Schnell MJ,Buonocore L,Kretzschmar E,et al.Foreign glycoproteins expressed from recombinant vesicular stomatitis viruses are incorporated efficiently into virus particles.Proc Natl Acad Sci USA1996:9321):11359-65. []孙洪正，徐自忠，周晓黎，等.水疱性口炎研究进展[J].动物医学进展，2007,28(10)： 72-76. [6]Chong L D,Rose J K.Membrane association of functional vesicular stomatitis virus matrix protein in vivo[J].J Virol,1993,67(1):407~414. [7]Hoffmann M,Wu Y J,Gerber M,et al.Fusion-active glycoprotein G mediates the cytotoxicity of vesicular stomatitis virus M mutants lacking host shut-off activity[J].J Gen Virol,2010,9(11): 2782~2793 [8]Kopecky S A,Lyles D S.The cell-rounding activity of the vesicular stomatitis virus matrix protein is due to the induction of cell death[J].JVirol,2003,77(9):5524~5528. [9]Bi Z,Barna M,Komatsu T,Reiss CS.Vesicular stomatitis virus infection of the central nervous system activates both innate and acquired immunity.J Viro/1995;69(10):6466-72. [10]Johnson JE,Nasar F,Coleman JW,et al.Neurovirulence properties of recombinant vesicular stomatitis virus vectors in non-human primates.Virology 2007;360(1):36-49. [11]STOJDL DF,LICHTY BD,TENOEVER BR,et al.VSV strains whith defects in their ability to shutdown innate immunity are potent systemic anti-cancer agents[j].Cancer Cell,2003, 4(4):263-275. [12]Lawson ND,Stillman EA,Whitt MA,et al.Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA.1995,92(10):4477-81. [13]Sambrook J,Russel1D".分子克隆实验指南[M].黄培堂等.3版.北京：科学出版社， 2008:1034. [14]HUANG TG,SAVONTAUS MJ,SHINOZAKI K,et al.Telomerase-dependnt oncolytic adenovirus for cancer treatment[J].Gene Ther,2003,10(15):1241-1247. [15]GARBUTT M,LIEBSCHER R,WAHL-JENSEN V,et al.Properties of replication -competent vesicular stomatitis virus vectors expressing glycoproteins of filoviruses and arenaviruses[J].J Virol,2004,78(10):5458-5465. [16]KELLY E J,HADAC E M,GREINER S,et al.Engineering microRNA responsiveness to decrease virus pathogenicity[J].Nat Med,2008,14(11):1278-1283
建了水泡性口炎病毒的M基因的第51位氨基酸缺失和第221位和226位氨基酸进行了突变的重 组水泡性口炎病毒（VSVΔMT），为后面的该病毒在本体动物上有效性和安全性研究提供了 基础和前提。 参考文献 [1].Rose JK, Whitt MA. Rhabdoviridae: the viruses and their replication. In: Knipe DM, Howley PM editors. Fields Virology, vol.1 Philadelphia: Lipopincot willianms &Wilkins, 2001, p.1221-1244. [2] Bridges VE, McCluskey BJ, Salman MD, et al. Review of the 1995 vesicular stomatitis outbreak in the western United States[J]. J Am Vet Med Assoc. 1997, 211(5):556-60. [3]Martinez I, Barrera JC, Rodriguez LL, et al. Recombinant vesicular stomatitis (Indiana) virus expressing New Jersey and Indiana glycoproteins induces neutralizing antibodies to each serotype in swine, a natural host. Vaccine 2004;22(29-30):4035–43. [4]Schnell MJ, Buonocore L, Kretzschmar E, et al. Foreign glycoproteins expressed from recombinant vesicular stomatitis viruses are incorporated efficiently into virus particles. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93(21): 11359–65. [5]孙洪正，徐自忠，周晓黎，等. 水疱性口炎研究进展[J]. 动物医学进展， 2007，28(10)： 72~76. [6]Chong L D, Rose J K.Membrane association of functional vesicular stomatitis virus matrix protein in vivo[J]. J Virol, 1993, 67(1):407~414. [7]Hoffmann M, Wu Y J, Gerber M, et al.Fusion-active glycoprotein G mediates the cytotoxicity of vesicular stomatitis virus M mutants lacking host shut-off activity[J]. J Gen Virol, 2010, 9(11): 2782~2793. [8]Kopecky S A, Lyles D S. The cell-rounding activity of the vesicular stomatitis virus matrix protein is due to the induction of cell death[J]. J Virol, 2003, 77(9): 5524~5528. [9] Bi Z, Barna M, Komatsu T, Reiss CS. Vesicular stomatitis virus infection of the central nervous system activates both innate and acquired immunity. J Virol 1995;69(10):6466–72. [10] Johnson JE, Nasar F, Coleman JW, et al. Neurovirulence properties of recombinant vesicular stomatitis virus vectors in non-human primates. Virology 2007;360(1):36–49. [11]STOJDL DF,LICHTY BD,TENOEVER BR,et al. VSV strains whith defects in their ability to shutdown innate immunity are potent systemic anti-cancer agents[j].Cancer Cell, 2003, 4(4) :263-275. [12] Lawson ND, Stillman EA, Whitt MA, et al. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 1995, 92(10):4477–81. [13]Sambrook J，Russell D W.分子克隆实验指南[M]．黄培堂等．3版．北京：科学出版社， 2008：1034. [14]HUANG TG, SAVONTAUS MJ, SHINOZAKI K, et al. Telomerase-dependnt oncolytic adenovirus for cancer treatment[J]. Gene Ther, 2003,10(15):1241-1247. [15]GARBUTT M, LIEBSCHER R, WAHL-JENSEN V, et al. Properties of replication –competent vesicular stomatitis virus vectors expressing glycoproteins of filoviruses and arenaviruses[J]. J Virol, 2004,78(10):5458-5465. [16]KELLY E J, HADAC E M, GREINER S, et al. Engineering microRNA responsiveness to decrease virus pathogenicity[J]. Nat Med, 2008, 14(11):1278-1283
