上海交通大学通识教育立项核心课程 MAO TONG 课程名称：生物技术与人类课程编号：B1906姓名：蒋一林 班级： F1116102学号： 5111619029专业：环境科学与工程 课程小论文 题目编号 (自拟)辅助生殖技术对基因组印 得分 迹影响的研究进展 序号 选题 1 “绿色革命”与农业基因工程 2 “黄金水稻”所引发的故事 3 美化环境的基因科学 4 世界首例艾滋病治愈前后观 5 从两性人说起性别的决定 6 DNA巧破悬案 7 从基因到药物的故事 8 耐药菌是如何生产的 9 化解能源危机的微生物 10 奥林匹克竞技场背后的基因高科技 11 姓氏背后的基因科学 12 基因间谍战 13 非典型战争一一生物战与基因武器 14 走进生物“芯”时代 15 人生预报一一 透过基因看未来 16 基因的伦理 17 转基因是天使还是恶魔
上海交通大学通识教育立项核心课程 课程名称： 生物技术与人类 课程编号： BI906 姓名： 蒋一林 班级： F1116102 学号： 5111619029 专业： 环境科学与工程 课程小论文 题目编号 （自拟）辅助生殖技术对基因组印 迹影响的研究进展 得分 序号 选题 1 “绿色革命”与农业基因工程 2 “黄金水稻”所引发的故事 3 美化环境的基因科学 4 世界首例艾滋病治愈前后观 5 从两性人说起性别的决定 6 DNA 巧破悬案 7 从基因到药物的故事 8 耐药菌是如何生产的 9 化解能源危机的微生物 10 奥林匹克竞技场背后的基因高科技 11 姓氏背后的基因科学 12 基因间谍战 13 非典型战争——生物战与基因武器 14 走进生物“芯”时代 15 人生预报——透过基因看未来 16 基因的伦理 17 转基因是天使还是恶魔
辅助生殖技术对基因组印迹影响的研究进展 蒋一林 (上海交通大学环境学院F1116102上海市东川路800号) 摘要：基因印迹是表观遗传学的一种，对配子形成、胚胎发育和出生后生长发育 具有重要意义。基因组印迹每一个繁殖周期都要经历擦除、重建、维持的规律性变化， 此过程发生在配子和胚胎的发育过程中。辅助生殖技术涉及配子发生、成熟和胚胎形成 的关键阶段，可能对基因组印迹变化产生影响。现已发现数种与辅助生殖技术相关的基 因印迹异常疾病 关键词：辅助生殖技术，基因组印迹，印迹基因，基因印迹异常疾病 ABSTRACT:Genomic imprinting is one kind of Epigenetics,which has vast importance to gametogenesis,embryogenesis and after birth development.Assisted reproductive technology is involved in the key phase when genomic imprinting goes through regular patterns of erasure,establishment,and maintenance.It may have effect on the change of genomic imprinting patterns.Until now,more and more evidence published showed that some ART might be related to genomic imprinting disorders. Keywords:Assisted reproductive technology,Genomic imprinting,Imprinting gene,Imprinting disorders 辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology,ART)是指运用医学技术和 方法对配子、合子、胚胎进行人工操作以达到受孕目的的技术，可分为人工授精 (Artificial Insemination,AI)和体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization and Embryo Transfer,IVF-ET)及其衍生技术两大类四。通过近几十年的发展，辅助生殖 技术已经成为治疗各种原因不孕的重要手段，全球目前已有3百多万儿童经由辅助生殖 技术出生。随着越来越多的ART新生儿降临于世，关于辅助生殖技术的安全性问题也成 为了研究热点。早在2O世纪末，就有学者对ART子代的出生缺陷进行描述：如Lancasterl2I 于1987年就指出IVF婴儿发生神经管畸形和大血管移位的比率增加，近年来的研究也表 明ART子代出现出生缺陷、低出生体重、染色体异常甚至罕见遗传病的发生率高于正常 儿童。所幸的是，ART技术的广泛应用和大量子代的出生及其成长为大范围的随访、 研究奠定了基础，这使得人们有机会深入调查辅助生殖技术的安全性。 几个小规模的临床实验已经报道经辅助生殖技术出生儿患基因印迹异常疾病的风 险较高4。在基因组印迹过程中，哺乳动物的雌性和雄性的生殖细胞在某一染色体区产 生了特定的性别印迹，经过不同的表遗传修饰，如DNA甲基化/去甲基化、组蛋白乙酰化 等，导致后代体细胞中两个亲本来源的基因组有不同的表达活性。印迹基因因其在配子 和胚胎发生过程中的特殊表达方式，与ART相关疾病之间的关系正日益受到关注。本文 在国内外一些文献期刊的基础上，结合最新的研究进展，就辅助生殖技术对基因组印迹 的影响作了简要综述。 1辅助生殖技术 辅助生殖技术包括人工授精(AI)、体外受精一胚胎移植(IVF-ET)、ICSI、种植前 遗传学诊断及其衍生的冻融胚胎移植、胚胎辅助孵化、卵子体外成熟培养等。 1890年，人工授精首次被应用于临床，但由于种种原因，直至1907年，辅助生殖技 术的研究工作才得到深入发展。1978年，世界第一例体外受精婴儿Louise Brown在英国
辅助生殖技术对基因组印迹影响的研究进展 蒋一林 （上海交通大学环境学院 F1116102 上海市东川路 800 号） 摘要：基因印迹是表观遗传学的一种，对配子形成、胚胎发育和出生后生长发育 具有重要意义。基因组印迹每一个繁殖周期都要经历擦除、重建、维持的规律性变化， 此过程发生在配子和胚胎的发育过程中。辅助生殖技术涉及配子发生、成熟和胚胎形成 的关键阶段，可能对基因组印迹变化产生影响。现已发现数种与辅助生殖技术相关的基 因印迹异常疾病 关键词：辅助生殖技术，基因组印迹，印迹基因，基因印迹异常疾病 ABSTRACT: Genomic imprinting is one kind of Epigenetics, which has vast importance to gametogenesis, embryogenesis and after birth development. Assisted reproductive technology is involved in the key phase when genomic imprinting goes through regular patterns of erasure, establishment, and maintenance. It may have effect on the change of genomic imprinting patterns. Until now, more and more evidence published showed that some ART might be related to genomic imprinting disorders. Keywords: Assisted reproductive technology, Genomic imprinting, Imprinting gene ,Imprinting disorders 辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology，ART）是指运用医学技术和 方法对配子、合子、胚胎进行人工操作以达到受孕目的的技术，可分为人工授精 （Artificial Insemination，AI）和体外受精-胚胎移植（In Vitro Fertilization and Embryo Transfer，IVF-ET）及其衍生技术两大类[1]。通过近几十年的发展，辅助生殖 技术已经成为治疗各种原因不孕的重要手段，全球目前已有3百多万儿童经由辅助生殖 技术出生。随着越来越多的ART新生儿降临于世，关于辅助生殖技术的安全性问题也成 为了研究热点。早在20世纪末，就有学者对ART子代的出生缺陷进行描述：如Lancaster [2] 于1987年就指出IVF婴儿发生神经管畸形和大血管移位的比率增加，近年来的研究也表 明ART子代出现出生缺陷、低出生体重、染色体异常甚至罕见遗传病的发生率高于正常 儿童[3]。所幸的是，ART技术的广泛应用和大量子代的出生及其成长为大范围的随访、 研究奠定了基础，这使得人们有机会深入调查辅助生殖技术的安全性。 几个小规模的临床实验已经报道经辅助生殖技术出生儿患基因印迹异常疾病的风 险较高[4]。在基因组印迹过程中，哺乳动物的雌性和雄性的生殖细胞在某一染色体区产 生了特定的性别印迹，经过不同的表遗传修饰，如DNA甲基化/去甲基化、组蛋白乙酰化 等，导致后代体细胞中两个亲本来源的基因组有不同的表达活性。印迹基因因其在配子 和胚胎发生过程中的特殊表达方式，与ART相关疾病之间的关系正日益受到关注。本文 在国内外一些文献期刊的基础上，结合最新的研究进展，就辅助生殖技术对基因组印迹 的影响作了简要综述。 1 辅助生殖技术 辅助生殖技术包括人工授精（AI）、体外受精—胚胎移植（IVF-ET）、ICSI、种植前 遗传学诊断及其衍生的冻融胚胎移植、胚胎辅助孵化、卵子体外成熟培养等[5]。 1890年，人工授精首次被应用于临床，但由于种种原因，直至1907年，辅助生殖技 术的研究工作才得到深入发展。1978年，世界第一例体外受精婴儿Louise Brown在英国
奥姻德总医院诞生，从此开启了辅助生殖技术的新时代。而我过国第一例试管婴儿则在 1988年诞生。到目前为止，配子移植技术、显微镜下透明带钻孔技术、透明带部分切除、 透明带下受精、单精子卵细胞浆内注射、配子和胚胎冻融技术以及植入前遗传学诊断等 新型辅助生殖技术也基本成熟，并已广泛应用于临床6]。 辅助生殖技术虽然为不孕症患者带来了福音，但是由于引入了大量非生理性的操 作，人为干预了受精及胚胎发育的关键时期，从而导致胚胎发育异常，子代出现缺陷等。 2基因组印迹 某些基因呈单等位基因表达，即父源与母源的基因拷贝不能同时表达，并且，父源 或母源等位基因通过某种特异的基因修饰机制，特异性地抑制另一母源或父源染色体等 位基因表达，使得在配子和胚胎形成过程中只表达父源或母源等位基因，这种现象被称 作基因组印迹(genomic imprinting),这些基因被称为印迹基因(imprinting gene)。 目前发现小鼠有印迹基因73个，人类有印迹基因243个，这些印迹基因表达与否取决于 其是来自父亲还是来自母亲。 2.1表遗传修饰与基因组印迹 表遗传修饰(epigenetic modification),是指对DNA双螺旋结构的修饰，并不涉及 DNA一级结构的改变，同时这种修饰所造成基因功能的改变，是可逆的，可遗传的)。 基因组印迹包括多种表观遗传修饰机制：DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白修饰、 逆转录、非转录RNA,包括microRNA等。DNA甲基化是基因组印迹最重要的机制之一，是 一种发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上的共价修饰，甲基化受DNA-5-甲酰基转移酶催化， 能导致染色质结构的变化，并且通常与基因的沉默表达有关8)，它对控制印迹基因中亲 源等位基因的表达具有重要作用。 2.2基因组印迹在配子和胚胎发育过程中的动态变化 基因组印迹在每一个繁殖周期都要经历一个擦除、重建、维持的过程，这3个过程 分别称为印迹去除、印迹形成以及印迹维持，它们在生殖细胞和胚胎发育过程中呈规律 性变化。在原始生殖细胞形成早期，来自父方和母方的印迹将全部被清除，但在生殖细 胞发育的后期重新建立，并且在形成合子后的发育阶段，通过体细胞的分裂被稳定的遗 传。在体细胞中，印迹被转录用于调节亲本特定合子基因的表达，因此仅有易感基因中 的父系或者母系的等位基因才有活性9。小鼠实验表明，双亲配子的基因组印迹会在每 一个繁殖周期擦除，然后在胚胎生殖细胞中进行性别特异性重建，并维持到下一个繁殖 周期。 2.2.1配子与印迹基因 印迹基因的本质是性别特异性标记导致的单等位基因表达，所以这种性别特异性标 记是发生在双亲基因组分开的阶段。在生殖细胞系建立这种性别特异性印迹前，双亲印 迹都被擦除掉。在小鼠体内，基因组印迹的擦除发生在一个很短的时间内，约24h(受孕 后第10.5~12.5天左右)，即原始生殖细胞进入生殖腺期间。对参与该过程的酶和分子 复合物仍有待进一步研究，但实验结果提示印迹擦除是一个主动擦除过程。 印迹擦除后再次建立的时间在雌性和雄性生殖细胞之间是有显著差别的。印迹基因 H19的甲基化差异位点在成熟精子中己发生甲基化，但在卵子中未发生甲基化。该位点 的甲基化在精原细胞时开始建立，完成于减数分裂的粗线期。在小鼠中，还有GTL2和 RASGRF1基因表现父源甲基化印迹。圆头精子显微注射的实验表明，在生殖细胞发育为 单倍体精子时，父源印迹已建立完成。Shamanski等将亚洲小鼠(Muscastaneus)的精子 细胞显微注射到小鼠(Musmusculus)的卵子后检测胚胎的基因印迹状态，结果其印迹基 因的表达与来自圆头精子注射所得胚胎的印迹基因表达很接近。 雌性生殖系统中，印迹建立发生在出生后阶段，此时卵子发育阻滞在减数第一次分 裂期(MI)的双线期。父源表达基因SNRPN的母源印迹就是在该阶段开始建立，同时
奥姆德总医院诞生，从此开启了辅助生殖技术的新时代。而我过国第一例试管婴儿则在 1988年诞生。到目前为止，配子移植技术、显微镜下透明带钻孔技术、透明带部分切除、 透明带下受精、单精子卵细胞浆内注射、配子和胚胎冻融技术以及植入前遗传学诊断等 新型辅助生殖技术也基本成熟，并已广泛应用于临床[6] 。 辅助生殖技术虽然为不孕症患者带来了福音，但是由于引入了大量非生理性的操 作，人为干预了受精及胚胎发育的关键时期，从而导致胚胎发育异常，子代出现缺陷等。 2 基因组印迹 某些基因呈单等位基因表达，即父源与母源的基因拷贝不能同时表达，并且，父源 或母源等位基因通过某种特异的基因修饰机制，特异性地抑制另一母源或父源染色体等 位基因表达，使得在配子和胚胎形成过程中只表达父源或母源等位基因，这种现象被称 作基因组印迹（genomic imprinting），这些基因被称为印迹基因（imprinting gene）。 目前发现小鼠有印迹基因73个，人类有印迹基因243个，这些印迹基因表达与否取决于 其是来自父亲还是来自母亲。 2.1 表遗传修饰与基因组印迹 表遗传修饰(epigenetic modification)，是指对DNA双螺旋结构的修饰，并不涉及 DNA一级结构的改变，同时这种修饰所造成基因功能的改变，是可逆的，可遗传的[7]。 基因组印迹包括多种表观遗传修饰机制：DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白修饰、 逆转录、非转录RNA，包括microRNA等。DNA甲基化是基因组印迹最重要的机制之一，是 一种发生在CpG 二核苷酸的胞嘧啶上的共价修饰, 甲基化受DNA-5-甲酰基转移酶催化， 能导致染色质结构的变化，并且通常与基因的沉默表达有关[8]，它对控制印迹基因中亲 源等位基因的表达具有重要作用。 2.2 基因组印迹在配子和胚胎发育过程中的动态变化 基因组印迹在每一个繁殖周期都要经历一个擦除、重建、维持的过程，这3个过程 分别称为印迹去除、印迹形成以及印迹维持，它们在生殖细胞和胚胎发育过程中呈规律 性变化。在原始生殖细胞形成早期,来自父方和母方的印迹将全部被清除，但在生殖细 胞发育的后期重新建立,并且在形成合子后的发育阶段，通过体细胞的分裂被稳定的遗 传。在体细胞中，印迹被转录用于调节亲本特定合子基因的表达，因此仅有易感基因中 的父系或者母系的等位基因才有活性[9]。小鼠实验表明，双亲配子的基因组印迹会在每 一个繁殖周期擦除，然后在胚胎生殖细胞中进行性别特异性重建，并维持到下一个繁殖 周期。 2.2.1 配子与印迹基因 印迹基因的本质是性别特异性标记导致的单等位基因表达，所以这种性别特异性标 记是发生在双亲基因组分开的阶段。在生殖细胞系建立这种性别特异性印迹前，双亲印 迹都被擦除掉。在小鼠体内，基因组印迹的擦除发生在一个很短的时间内，约24h(受孕 后第10.5～12.5天左右)，即原始生殖细胞进入生殖腺期间。对参与该过程的酶和分子 复合物仍有待进一步研究，但实验结果提示印迹擦除是一个主动擦除过程。 印迹擦除后再次建立的时间在雌性和雄性生殖细胞之间是有显著差别的。印迹基因 H19的甲基化差异位点在成熟精子中已发生甲基化，但在卵子中未发生甲基化。该位点 的甲基化在精原细胞时开始建立，完成于减数分裂的粗线期。在小鼠中，还有GTL2和 RASGRFl基因表现父源甲基化印迹。圆头精子显微注射的实验表明，在生殖细胞发育为 单倍体精子时，父源印迹已建立完成。Shamanski等将亚洲小鼠(Muscastaneus)的精子 细胞显微注射到小鼠(Musmusculus)的卵子后检测胚胎的基因印迹状态，结果其印迹基 因的表达与来自圆头精子注射所得胚胎的印迹基因表达很接近[10]。 雌性生殖系统中，印迹建立发生在出生后阶段，此时卵子发育阻滞在减数第一次分 裂期(M I)的双线期。父源表达基因SNRPN的母源印迹就是在该阶段开始建立，同时
IGF2R,PEG1和PEG3基因的印迹完成于减数第二次分裂(MⅡ)。出生后处于各个发育阶段 卵子的核移植实验结果也支持印迹建立完成于MⅡ期。 2.2.2胚胎与印迹基因 在胚胎植入前发育阶段，当基因组发生广泛去甲基化的动态变化时，印迹基因必须 完整地维持其在配子形成期所建立的印迹状态。整个基因组（除印迹基因外）序列，在发 育至囊胚阶段时达到甲基化程度的最低峰，之后，基因组开始从头甲基化。在种植前阶 段，当基因组范围内的低甲基化发生时，印迹基因维持其配子来源的特异性标记，并在 以后的发育阶段中导致性别特异性的单等位基因表达。 l991年，Haig等提出双亲对抗假说(parentalconflict hypothesis),认为：① 父源基因组表达的基因有利于胚胎最大程度利用母源资源，使其得到最佳生长发育，从 而保证自己的基因良好地传递给下一代。②母源基因组表达的基因用于抵消父源基因的 影响，使胚胎得以在耗资最小的环境下生长发育，而为下一次妊娠保留资源。双雄原核 来源的胚胎表现为胚外组织增生而胚胎发育严重缺陷；相反，双雌原核来源的胚胎可较 正常地发育到体节阶段，但胚外组织发育缺陷。这样的实验结果表明，父源和母源基因 组具有相反的作用，父源表达基因通过指导胚外组织发育来支持胚胎发育，而母源表达 基因直接控制胚胎发育。 在人类体内，对印迹基因在配子和胚胎发育过程中的甲基化动态研究存在一定的局 限性，而有限的实验数据表明，印迹基因在人类中的动态变化与其小鼠中的具有一定的 保守性。H19基因的父源甲基化印迹在人和小鼠中表现保守。在胎儿生殖母细胞内，H19 基因没有发生甲基化，但是在成人精原细胞和随后的发育阶段中，H19基因建立并维持 了其印迹状态。Jinno等的实验表明，在胚胎植入前阶段H19基因的父源印迹状态在小鼠 和人类中是保守的21。 3辅助生殖技术和人类疾病 3.1辅助生殖技术环节对基因组印迹的影响 基因组印迹的机制主要是指在印迹擦除、重建或维持过程中发生DNA甲基化、组蛋 白修饰改变，而DNA序列不发生改变。DNA甲基化改变有过度甲基化及甲基化丢失，从 而引起基因表达的变化，引发各种疾病。印迹基因变化周期中的任何一个环节出现错误 都可能导致胚胎发育缺陷，甚至死亡。而辅助生殖技术涉及配子的发生、成熟及胚胎形 成等关键阶段，故可能对基因的印迹变化存在各种影响。 控制性超排卵技术(COH)是指应用药物手段在可控制的范围内诱发多卵泡的发育 和成熟，为一系列辅助生殖技术奠定基础。C0H可能干扰基因组印迹的建立和维持。随 后的卵子体外成熟以及卵子或卵巢组织冷冻技术，在保存生育力方面发挥了重要作用， 但由于卵子母源印迹基因获得印迹的过程贯穿整个卵子发育和成熟期，易受外界环境影 响，因此该技术也可能影响正常的印迹基因获得过程 体外受精-胚胎移植(IVF-ET)涉及从母体取出的卵子置于培养皿内，加入经优选 诱导获能处理的精子，受精卵在体外受精，并发育成前期胚胎后移植回母体子宫内，经 妊娠后分娩婴儿。卵泡浆内单精子显微注射(ICSI)是在针对男性精子数量不足，功能 异常导致受精障碍所采取的手段。涉及精子的选择以及卵子透明带和细胞质受损等过 程。IV℉或ICSI都使原核期合子去甲基化过程受限，可能造成后续重新甲基化异常3)， 进而引起印迹基因修饰异常。 3.2辅助生殖技术对雌性生殖细胞的影响 辅助生殖技术过程中的许多操作如超排卵或未成熟卵的体外培养均会影响到卵母 细胞生长和成熟阶段的印迹。（具体原因可能是母系甲基化印迹建立阶段或在正常雌性 生殖系中未被甲基化的印迹基因的保护阶段受到了影响。14)目前还没有资料显示临床 应用高剂量的促性腺激素使大量卵母细胞同时成熟是否会改变卵母细胞基因印迹的获
IGF2R，PEGl和PEG3基因的印迹完成于减数第二次分裂(MⅡ)。出生后处于各个发育阶段 卵子的核移植实验结果也支持印迹建立完成于MⅡ期。 2.2.2 胚胎与印迹基因 在胚胎植入前发育阶段，当基因组发生广泛去甲基化的动态变化时，印迹基因必须 完整地维持其在配子形成期所建立的印迹状态。整个基因组(除印迹基因外)序列，在发 育至囊胚阶段时达到甲基化程度的最低峰，之后，基因组开始从头甲基化。在种植前阶 段，当基因组范围内的低甲基化发生时，印迹基因维持其配子来源的特异性标记，并在 以后的发育阶段中导致性别特异性的单等位基因表达。 1991年，Haig等提出双亲对抗假说(parentalconflict hypothesis) [11, 12]认为：① 父源基因组表达的基因有利于胚胎最大程度利用母源资源，使其得到最佳生长发育，从 而保证自己的基因良好地传递给下一代。②母源基因组表达的基因用于抵消父源基因的 影响，使胚胎得以在耗资最小的环境下生长发育，而为下一次妊娠保留资源。双雄原核 来源的胚胎表现为胚外组织增生而胚胎发育严重缺陷；相反，双雌原核来源的胚胎可较 正常地发育到体节阶段，但胚外组织发育缺陷。这样的实验结果表明，父源和母源基因 组具有相反的作用，父源表达基因通过指导胚外组织发育来支持胚胎发育，而母源表达 基因直接控制胚胎发育。 在人类体内，对印迹基因在配子和胚胎发育过程中的甲基化动态研究存在一定的局 限性，而有限的实验数据表明，印迹基因在人类中的动态变化与其小鼠中的具有一定的 保守性。H19基因的父源甲基化印迹在人和小鼠中表现保守。在胎儿生殖母细胞内，H19 基因没有发生甲基化，但是在成人精原细胞和随后的发育阶段中，H19基因建立并维持 了其印迹状态。Jinno等的实验表明，在胚胎植入前阶段H19基因的父源印迹状态在小鼠 和人类中是保守的[21]。 3 辅助生殖技术和人类疾病 3.1 辅助生殖技术环节对基因组印迹的影响 基因组印迹的机制主要是指在印迹擦除、重建或维持过程中发生DNA甲基化、组蛋 白修饰改变，而DNA序列不发生改变。DNA甲基化改变有过度甲基化及甲基化丢失[1]，从 而引起基因表达的变化，引发各种疾病。印迹基因变化周期中的任何一个环节出现错误 都可能导致胚胎发育缺陷，甚至死亡。而辅助生殖技术涉及配子的发生、成熟及胚胎形 成等关键阶段，故可能对基因的印迹变化存在各种影响。 控制性超排卵技术（COH）是指应用药物手段在可控制的范围内诱发多卵泡的发育 和成熟，为一系列辅助生殖技术奠定基础。COH可能干扰基因组印迹的建立和维持。随 后的卵子体外成熟以及卵子或卵巢组织冷冻技术，在保存生育力方面发挥了重要作用， 但由于卵子母源印迹基因获得印迹的过程贯穿整个卵子发育和成熟期，易受外界环境影 响，因此该技术也可能影响正常的印迹基因获得过程 体外受精-胚胎移植（IVF-ET）涉及从母体取出的卵子置于培养皿内，加入经优选 诱导获能处理的精子，受精卵在体外受精，并发育成前期胚胎后移植回母体子宫内，经 妊娠后分娩婴儿。卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）是在针对男性精子数量不足，功能 异常导致受精障碍所采取的手段。涉及精子的选择以及卵子透明带和细胞质受损等过 程。IVF或ICSI都使原核期合子去甲基化过程受限，可能造成后续重新甲基化异常[13]， 进而引起印迹基因修饰异常。 3.2 辅助生殖技术对雌性生殖细胞的影响 辅助生殖技术过程中的许多操作如超排卵或未成熟卵的体外培养均会影响到卵母 细胞生长和成熟阶段的印迹。（具体原因可能是母系甲基化印迹建立阶段或在正常雌性 生殖系中未被甲基化的印迹基因的保护阶段受到了影响。[14]）目前还没有资料显示临床 应用高剂量的促性腺激素使大量卵母细胞同时成熟是否会改变卵母细胞基因印迹的获
得，但是促性腺激素可导致还未完成印迹过程的卵母细胞过早释放这一点已被证明。Van der Auwer等5已通过小鼠实验证明超排卵会导致胚胎发育迟缓：ShiW16等通过抗-5 甲基胞嘧啶抗体的免疫荧光染色显示，超排卵得到的胚胎与非超排卵得到的胚胎相比， 在两细胞胚胎期具有较高的异常甲基化发生率。 3.3辅助生殖技术对早期胚胎的影响 植入前胚胎的发育阶段同步于基因组中的甲基化印迹的维持阶段是同步的。Khoslaā S对于小鼠和羊的实验已显示，胚胎体外培养可能对印迹产生影响。在胚胎体外培养 可能对印迹产生影响的问题包括深低温保藏、培养时缺少配子形成时期必需的印迹维持 成分，对已存在印迹干扰和对非甲基化的等位基因缺乏保护而使其甲基化等等。尽管没 有实验证实胚胎的深低温保存与细胞骨架和胚胎植入前生长阶段中与甲基化和去甲基 化相关酶的活性之间有什么必然联系，但是包括深低温保存在内的各种用于临床的培养 基和囊胚的延时培养对胚胎的影响，仍值得我们注意。 3.4辅助生殖技术与基因印迹异常疾病 3.4.1辅助生殖技术与Beckwith-Wiedemann综合征 Beckwith-Wiedemann综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome普-威综合征，BWS) 是一种表现出过度生长的疾病，特征是出生前后过度生长，新生儿低血糖，巨舌，巨大 症以及胚瘤的高发病率，例如威尔姆斯瘤、横纹肌肉瘤和肝母细胞瘤14,18,19。BWS发生 率为每13700个儿童中出现一位患者18)，大部分病人有在母系等位基因染色体11p15的两 个甲基化区域中的一个有基因印迹缺陷。Oyce JA等人通过研究发现在BWS患者中存在 IGF2印迹丢失的现象，即被印迹的非活性等位基因被重新激活，造成双等位基因均表达 而引起过度2o),而在正常情况下，IGF2只有父源等位基因表达。 许多研究表明，BWS与辅助生殖技术存在一定联系。Mather等回顾大量的散发BWS病 例，试图寻找与ART的关系。在诊断出的149例BWS病例中有6例是经ART出生的，其中2例存 在KCNQ10T1印迹丢失。与普通人群的发病率比较，ART与BWS的关联性比正常妊娠出生者 高4倍21。Hal1iday曾报道656个BWS病例中的53个(5.9%)的母亲曾使用过辅助生殖技 术，而正常人群的患病率仅为0.O07%22。此外，还可通过研究ART的BWS的分子基础，来 探讨BWS是否可归因于ART导致的基因印迹缺陷。一些研究显示，BWS的分子机制研究显 示IC2的低甲基化占所有BWS的50%：IC1的高甲基化占5%，为upd(11)pat。20%的BWS中出 现父系的11pl5单亲二倍体；未知病例(20%)。IC2中母系CDKN1C基因印迹的突变(5%)， 以及很少的结构变异或CNVs(3%)。由此可见，75%的BWS患者中，就会出现一个表观遗 传学病因。 群体中BWS既包含父系等位基因的重复，还包含母系等位基因在不同的印迹区域的 功能丢失。而与辅助生殖技术相关的BWS主要缺陷是母系等位基因上的甲基化丢失。这 些现象表明母系基因可能比父系基因更脆弱、更易遭受表遗传印迹损伤0。 3.4.2辅助生殖技术与Angelman综合征 Angelman综合征(Angelman Syndrome安吉尔曼综合征，AS),以严重的智力低下， 语言能力的缺乏，共济失调，癫痫以及活动过度为主要特点，在1965年首先被认识23。 母系15q11.2-q13基因的缺失导致安吉尔曼综合征，父系相同位点的基因缺失加重病情 进一步导致Prager--Willi综合征。这一区域包含SNRPN和UBE3A基因，这些基因都是 印迹基因.30年后研究发现仅UBE3A的基因变异导致安吉尔曼综合征24。有趣的是UBE3A 基因在人脑中发生印迹效应，且仅在母系拷贝表达而父系拷贝沉默。有5个主要的基因 导致AS:(1)母源染色体15q11.2-q13缺失(68%)，(2)父源单性生殖的二体性15(7%)， (3)UBE3A基因变异(11%)，(4)印迹瑕疵(3%)，(5)UBE3A部分或者整个基因缺失 (稀少)。AS中大约3%患者的致病基因为印迹瑕疵2。 三项研究26-28中表明，在运用了辅助生殖技术的AS病人中，252中的23个AS病 人(9.1%)有生殖障碍。研究中显示23个病人中有4个(17.4%)有低甲基化。更为重 要的是3个IV℉的病人中，1人具有印迹病因。剩下的案例都是生殖障碍，20个中3
得，但是促性腺激素可导致还未完成印迹过程的卵母细胞过早释放这一点已被证明。Van der Auwer等[15]已通过小鼠实验证明超排卵会导致胚胎发育迟缓；Shi W [16]等通过抗-5 甲基胞嘧啶抗体的免疫荧光染色显示 ，超排卵得到的胚胎与非超排卵得到的胚胎相比， 在两细胞胚胎期具有较高的异常甲基化发生率。 3.3 辅助生殖技术对早期胚胎的影响 植入前胚胎的发育阶段同步于基因组中的甲基化印迹的维持阶段是同步的。Khosla S [17]对于小鼠和羊的实验已显示，胚胎体外培养可能对印迹产生影响。在胚胎体外培养 可能对印迹产生影响的问题包括深低温保藏、培养时缺少配子形成时期必需的印迹维持 成分，对已存在印迹干扰和对非甲基化的等位基因缺乏保护而使其甲基化等等。尽管没 有实验证实胚胎的深低温保存与细胞骨架和胚胎植入前生长阶段中与甲基化和去甲基 化相关酶的活性之间有什么必然联系，但是包括深低温保存在内的各种用于临床的培养 基和囊胚的延时培养对胚胎的影响，仍值得我们注意。 3.4 辅助生殖技术与基因印迹异常疾病 3.4.1 辅助生殖技术与Beckwith-Wiedemann综合征 Beckwith-Wiedemann综合征（Beckwith-Wiedemann Syndrome普-威综合征, BWS） 是一种表现出过度生长的疾病，特征是出生前后过度生长，新生儿低血糖，巨舌，巨大 症以及胚瘤的高发病率，例如威尔姆斯瘤、横纹肌肉瘤和肝母细胞瘤[14,18,19]。BWS发生 率为每13700个儿童中出现一位患者[18]，大部分病人有在母系等位基因染色体11p15的两 个甲基化区域中的一个有基因印迹缺陷。Oyce JA等人通过研究发现在BWS患者中存在 IGF2印迹丢失的现象，即被印迹的非活性等位基因被重新激活, 造成双等位基因均表达 而引起过度[20]，而在正常情况下，IGF2只有父源等位基因表达。 许多研究表明，BWS与辅助生殖技术存在一定联系。Mather等回顾大量的散发BWS病 例,试图寻找与ART的关系。在诊断出的149例BWS病例中有6例是经ART出生的,其中2例存 在KCNQ10T1印迹丢失。与普通人群的发病率比较,ART与BWS的关联性比正常妊娠出生者 高4倍[21]。Halliday曾报道656个BWS病例中的53个（5.9%）的母亲曾使用过辅助生殖技 术，而正常人群的患病率仅为0.007% [22]。此外，还可通过研究ART的BWS的分子基础，来 探讨BWS是否可归因于ART导致的基因印迹缺陷。一些研究显示，BWS的分子机制研究显 示IC2的低甲基化占所有BWS的50%；IC1的高甲基化占5%，为upd(11)pat。20%的BWS中出 现父系的11p15单亲二倍体；未知病例（20%）。IC2中母系CDKN1C基因印迹的突变（5%）， 以及很少的结构变异或CNVs（3%）。由此可见，75%的BWS患者中，就会出现一个表观遗 传学病因。 群体中 BWS 既包含父系等位基因的重复，还包含母系等位基因在不同的印迹区域的 功能丢失。而与辅助生殖技术相关的 BWS 主要缺陷是母系等位基因上的甲基化丢失。这 些现象表明母系基因可能比父系基因更脆弱、更易遭受表遗传印迹损伤[20]。 3.4.2 辅助生殖技术与 Angelman 综合征 Angelman 综合征（Angelman Syndrome 安吉尔曼综合征, AS），以严重的智力低下， 语言能力的缺乏，共济失调，癫痫以及活动过度为主要特点，在 1965 年首先被认识[23]。 母系 15q11.2-q13 基因的缺失导致安吉尔曼综合征，父系相同位点的基因缺失加重病情 进一步导致 Prager-Willi 综合征。这一区域包含 SNRPN 和 UBE3A 基因，这些基因都是 印迹基因。30年后研究发现仅UBE3A的基因变异导致安吉尔曼综合征[24]。有趣的是UBE3A 基因在人脑中发生印迹效应，且仅在母系拷贝表达而父系拷贝沉默。有 5 个主要的基因 导致 AS：（1）母源染色体 15q11.2-q13 缺失（68%），（2）父源单性生殖的二体性 15（7%）， （3）UBE3A 基因变异（11%），（4）印迹瑕疵（3%），（5）UBE3A 部分或者整个基因缺失 （稀少）。AS 中大约 3%患者的致病基因为印迹瑕疵[25]。 三项研究[26-28]中表明，在运用了辅助生殖技术的 AS 病人中，252 中的 23 个 AS 病 人（9.1%）有生殖障碍。研究中显示 23 个病人中有 4 个（17.4%）有低甲基化。更为重 要的是 3 个 IVF 的病人中，1 人具有印迹病因。剩下的案例都是生殖障碍，20 个中 3
个(15%)低甲基化。在所有的AS患者中印迹改变的概率接近3%，但是由于适用辅助 生殖技术的案例太少，无法明确辅助生殖技术与引起印迹紊乱的必然联系。Amor和 Halliday等人对AS进行了回顾性研究29)，结论如下：(1)AS在普遍人群中具有罕见性 (约1/15000)(2)AS的发生与印迹功能缺陷有关（约3%），(3)辅助生殖技术婴儿的 年出生率是1~3%。以上三项巧合均发生，那么大约2千万的新生儿中才会出现一例， 如此小的概率正好提示了AS与辅助生殖技术的内在联系。 3.4.3辅助生殖技术与Si1ver-Russel1综合征 Silver-Russell综合征(Silver-Russel1 Syndrome,SRS)是一组遗传异质性的 疾病，主要临床表现为胎儿严重的宫内生长发育迟缓及出生后生长发育迟缓和矮身材 30,儿童中发病率约为1/10万3.60%的患儿是由于在在染色体11pl5上的父源等位基因 的DMR1出现印迹缺陷（低甲基化）B2。Kagami M仅有5例IVF/ICSI出生儿患SRS的报道， 2例患儿进行了分子学检查，其中1例为IVF出生儿，结果显示在7qDMR(MEST)的父源等位 基因表现为过度甲基化3)。最近的一些研究报导了9位应用辅助生殖技术的SRS患者 34-36。在这9位患者中，6位(67%)发现在11p15上的DMR1有印迹缺陷（低甲基化)B, 这些研究提示了辅助生殖技术与SRS印迹缺陷的关系。 综上所述，辅助生殖技术引发印迹基因异常的流行病趋势需要得到进一步的关注。 5展望 随着辅助生殖技术的进一步推广，我们可以预见到因辅助生殖技术所导致的遗传 病患者会大量增加，但这并不意味着辅助生殖技术应该被禁止。相反，我们可以通过对 基因表观遗传的深入研究，对基因印迹疾病分子水平层面上的进一步认识来分析病变基 因的修饰状态，从而阐明发病机制，进而探究并修正辅助生殖技术在胚胎发育过程中所 存在的缺憾，避免患儿的诞生。 References [1]王增艳，徐苓，何方方.辅助生殖技术与基因印记的关系.生殖医学杂志，2009,18(4)： 414-418 [2]Lancaster PA.Congenital malformations after in-vitro fertilisation.Lancet,1987,2(8572) 1392-1393 [3]章瑜，黄荷凤.辅助生殖技术安全性研究进展.中国实用妇科与产科杂志，2010，(10)： 796-800. [4]熊夏思.辅助生殖技术对PWS/AS印记调控区SNRPN基因甲基化状态的影响DL.南 方医科大学，2008. [5]陈琰，徐仙.辅助生殖技术与出生缺陷[).宁夏医学杂志，2013,35(9)：869-871 [6]王晓峰，赵永平.男性不育与现代辅助生殖技术.中华医学信息导报，2011,26(13)19-20， [7刀李雅琼，黄燕芳等.印记基因对胚胎发育的影响[J.国际遗传学杂志，2013,36(2)：74-79 [8]Dennis C.Epigenetics and disease:Altered states.Nature,2003,421(6924):686-688 [9]胡琳莉，朱桂金.遗传印记与辅助生殖.中国优生与遗传杂志，2007，(04)：6-8. [10]Shamanski FL,Kimura Y,Lavoir MC,Pedersen RA,Yanagimachi R.Status of genomic imprinting in mouse spermatids.Human reproduction (Oxford,England),1999,14(4): 1050-1056 [11]Haig D,Westoby M.An earlier formulation of the genetic conflict hypothesis of genomic imprinting.Nat Genet,2006,38(3):271
个（15%）低甲基化。在所有的 AS 患者中印迹改变的概率接近 3%，但是由于适用辅助 生殖技术的案例太少，无法明确辅助生殖技术与引起印迹紊乱的必然联系。Amor 和 Halliday 等人对 AS 进行了回顾性研究[29]，结论如下：（1）AS 在普遍人群中具有罕见性 （约 1/15000）（2）AS 的发生与印迹功能缺陷有关（约 3%），（3）辅助生殖技术婴儿的 年出生率是 1～3%。以上三项巧合均发生，那么大约 2 千万的新生儿中才会出现一例， 如此小的概率正好提示了 AS 与辅助生殖技术的内在联系。 3.4.3 辅助生殖技术与Silver - Russell综合征 Silver-Russell综合征（Silver–Russell Syndrome，SRS）是一组遗传异质性的 疾病, 主要临床表现为胎儿严重的宫内生长发育迟缓及出生后生长发育迟缓和矮身材 [30],儿童中发病率约为1/10万[31]。60%的患儿是由于在在染色体11p15上的父源等位基因 的DMR1出现印迹缺陷（低甲基化）[32]。Kagami M仅有5例IVF／ICSI出生儿患SRS的报道， 2例患儿进行了分子学检查，其中1例为IVF出生儿，结果显示在7qDMR(MEST)的父源等位 基因表现为过度甲基化[33]。最近的一些研究报导了9位应用辅助生殖技术的SRS患者 [34-36]。在这9位患者中，6位（67%）发现在11p15上的DMR1有印迹缺陷（低甲基化）[37]， 这些研究提示了辅助生殖技术与SRS印迹缺陷的关系。 综上所述，辅助生殖技术引发印迹基因异常的流行病趋势需要得到进一步的关注。 5 展望 随着辅助生殖技术的进一步推广，我们可以预见到因辅助生殖技术所导致的遗传 病患者会大量增加，但这并不意味着辅助生殖技术应该被禁止。相反，我们可以通过对 基因表观遗传的深入研究，对基因印迹疾病分子水平层面上的进一步认识来分析病变基 因的修饰状态，从而阐明发病机制，进而探究并修正辅助生殖技术在胚胎发育过程中所 存在的缺憾，避免患儿的诞生。 References [1] 王增艳,徐苓,何方方.辅助生殖技术与基因印记的关系.生殖医学杂志,2009,18(4): 414-418. [2] Lancaster PA.Congenital malformations after in-vitro fertilisation. Lancet,1987,2(8572): 1392-1393. [3] 章瑜,黄荷凤.辅助生殖技术安全性研究进展.中国实用妇科与产科杂志,2010,(10): 796-800. [4]熊夏思.辅助生殖技术对 PWS/AS 印记调控区 SNRPN 基因甲基化状态的影响[D].南 方医科大学,2008. [5]陈琰,徐仙.辅助生殖技术与出生缺陷[J].宁夏医学杂志,2013,35(9):869-871. [6]王晓峰,赵永平.男性不育与现代辅助生殖技术.中华医学信息导报,2011,26(13):19-20. [7]李雅琼,黄燕芳等..印记基因对胚胎发育的影响[J].国际遗传学杂志,2013,36(2):74-79. [8]Dennis C. Epigenetics and disease: Altered states. Nature,2003,421(6924):686-688. [9]胡琳莉,朱桂金.遗传印记与辅助生殖.中国优生与遗传杂志,2007,(04):6-8. [10]Shamanski FL, Kimura Y, Lavoir MC, Pedersen RA, Yanagimachi R. Status of genomic imprinting in mouse spermatids. Human reproduction (Oxford, England),1999,14(4): 1050-1056. [11]Haig D, Westoby M. An earlier formulation of the genetic conflict hypothesis of genomic imprinting. Nat Genet,2006,38(3):271
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