全部载体的1/3。非病毒载体以脂质体居多,而裸质粒DNA的应用有逐渐上升的趋势。目前 所用的载体尚不尽人意,有些是存在着安全性问题,有些则为效率不高等缺点。下面将讨论 几类常用载体的构建极其优点。 (一)逆转录病毒载体 1.逆转录病毒载体的构建 逆转录病毒( retrovirus)属RNA病毒,通过其本身逆转录酶的作用,形成双链DNA原病毒, 然后整合于宿主细胞染色体中,详细的基因结构及生活史见第十三章。构建载体时以DNA原 病毒为基础,将野生型病毒的3类结构基因gqg,pol和em删除,以供外源基因的插入,但 是要保存病毒的包装序列(ψ)和双侧的长末端重复(LTR),LTR含有启动子、增强子、整 合信号及 poly A信号等多种元件插入的基因一般为两种或两种以上,一种为标记基因( marker gene)供阳性筛选,常用的为原核细胞的新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ,neσ基因),该酶能 破坏抗生素G418(新霉素的衍生物)的活性。哺乳动物细胞在含G418的培养液中不能生长 若含有neo"基因能产生NPTⅡ,即能在含有G418的培养液中生长,故便于筛选转导基因的 细胞 另一种为供治疗用的基因,治疗基因和标记基因可识别受控于不同启动子,其中一种受 逆转录病毒的LIR调控,另一种常需连接另外的启动子序列,或者连接一种称为内核糖体进 入位点序列(IRES),使转录成一条多顺反子mRNA,在翻译过程中IRES具有内启动作用 能启动蛋白质的合成,所以同一分子mRNA能合成2种或2种以上不同的蛋白质 如何包装成含有外源基因的逆转录病毒供治疗用的呢?因为载体本身的3类结构基因已 被删除,因此包装所需的结构蛋白质,需要靠一种所谓的包装细胞,如PA317,提供,这种细 胞含有一种缺失包装信号的逆转录病毒,只能产生包装所需的结构蛋白质,但本身的病毒RNA 因缺失包装信号所以不会被包装成病毒颗粒,这对治疗的安全性很重要,可避免产生有复制 潜能的逆转录病毒(RCR)。将上述所构建的载体转染包装细胞PA317,可产生供治疗用的含 有治疗基因的逆转录病毒颗粒,见图21-8,这种病毒能高效感染细胞,使治疗基因能够整合 至细胞的染色体中,从而能长期表达基因产物,以达到治疗目的 2.逆转录病毒载体的优缺点9 全部载体的 1/3。非病毒载体以脂质体居多，而裸质粒 DNA 的应用有逐渐上升的趋势。目前 所用的载体尚不尽人意，有些是存在着安全性问题，有些则为效率不高等缺点。下面将讨论 几类常用载体的构建极其优点。 （一）逆转录病毒载体 1. 逆转录病毒载体的构建 逆转录病毒(retrovirus)属 RNA 病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链 DNA 原病毒, 然后整合于宿主细胞染色体中, 详细的基因结构及生活史见第十三章。构建载体时以 DNA 原 病毒为基础，将野生型病毒的 3 类结构基因 gag，pol 和 env 删除，以供外源基因的插入，但 是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR 含有启动子、增强子、整 合信号及 poly A 信号等多种元件。插入的基因一般为两种或两种以上，一种为标记基因（marker gene）供阳性筛选，常用的为原核细胞的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPT Ⅱ,neoR 基因），该酶能 破坏抗生素 G418（新霉素的衍生物）的活性。哺乳动物细胞在含 G418 的培养液中不能生长， 若含有 neoR基因能产生 NPT Ⅱ，即能在含有 G418 的培养液中生长，故便于筛选转导基因的 细胞。 另一种为供治疗用的基因，治疗基因和标记基因可识别受控于不同启动子，其中一种受 逆转录病毒的 LTR 调控，另一种常需连接另外的启动子序列，或者连接一种称为内核糖体进 入位点序列（IRES），使转录成一条多顺反子 mRNA，在翻译过程中 IRES 具有内启动作用， 能启动蛋白质的合成，所以同一分子 mRNA 能合成 2 种或 2 种以上不同的蛋白质。 如何包装成含有外源基因的逆转录病毒供治疗用的呢？因为载体本身的 3 类结构基因已 被删除，因此包装所需的结构蛋白质，需要靠一种所谓的包装细胞，如 PA317, 提供，这种细 胞含有一种缺失包装信号的逆转录病毒，只能产生包装所需的结构蛋白质，但本身的病毒 RNA 因缺失包装信号,所以不会被包装成病毒颗粒，这对治疗的安全性很重要，可避免产生有复制 潜能的逆转录病毒（RCR）。将上述所构建的载体转染包装细胞 PA317，可产生供治疗用的含 有治疗基因的逆转录病毒颗粒，见图 21-8，这种病毒能高效感染细胞，使治疗基因能够整合 至细胞的染色体中，从而能长期表达基因产物，以达到治疗目的。 2. 逆转录病毒载体的优缺点