第二十一章基因诊断与基因治疗 基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实,主要是由于分子生物学 的理论及技术方法,特别是重组DNA技术的迅速发展,使人们可以在实验室构建各种载体、 克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究,并已取得了重大的进展。因 此在20世纪70年代末诞生了基因诊断( gene diagnosis};随后于1990年美国实施了第一个基 因治疗( gene therapy)的临床试验方案。可见,基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和 技术与医学相结合的范例。 第一节基因诊断 基因诊断的含义 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据,如患者的症状、血尿各项指标的变 化,或物理检査的异常结果,然而表型的改变在许多情况下不是特异的,而且是在疾病发生 的一定时间后才出现,因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常 造成的,也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术 方法来分析受检者的某一特定基因的结构(DNA水平)或功能(RNA水平)是否异常,以此 来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断( dnA diagnosis)基因 诊断是病因的诊断,既特异又灵敏,可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态,从而 可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测,特别对确定有遗传疾病家族 史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义 基因诊断的原理及方法 (一)基因诊断的原理 疾病的发生不仅与基因结构的变异有关,而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本 原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。由于DNA的突变、 缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结枃变异,因此,可以直接检测上述的变 化或利用连锁方法进行分析,这就是DNA诊断 对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断( RNA diagnosis) (二)基因诊断的方法
1 第二十一章 基因诊断与基因治疗 基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学 的理论及技术方法，特别是重组 DNA 技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、 克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。因 此在 20 世纪 70 年代末诞生了基因诊断(gene diagnosis)；随后于 1990 年美国实施了第一个基 因治疗(gene therapy)的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和 技术与医学相结合的范例。 第一节 基因诊断 一. 基因诊断的含义 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变 化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生 的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常 造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术 方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA 水平）或功能（RNA 水平）是否异常，以此 来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或 DNA 诊断(DNA diagnosis)。基因 诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而 可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族 史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。 二. 基因诊断的原理及方法 （一）基因诊断的原理 疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本 原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是 RNA 产物是否正常。由于 DNA 的突变、 缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述的变 化或利用连锁方法进行分析，这就是 DNA 诊断。 对表达产物 mRNA 质和量变化的分析为 RNA 诊断(RNA diagnosis)。 （二）基因诊断的方法
基因诊断是以核酸分子杂交( nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应(PCR) 为核心发展起来的多种方法,同时配合DNA序列分析,近年新兴的基因芯片可能会发展成为 一种很有用的基因诊断方法 1.DNA诊断 常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种 (1)斑点杂交:根据待测DNA样本与标记的DNA探针杂交的图谱,可以判断目标基因 或相关的DNA片段是否存在,根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量 (2)等位基因特异的寡核苷酸探针(alle- specific oligonucleotide probe, ASO probe)杂交: 是一种检测基因点突变的方法,根据点突变位点上下游核苷酸序列,人工合成约19个核苷酸 长度的片段,突变的碱基位于当中,经放射性核素或地高辛标记后可作为探针,在严格杂交 条件下,只有该点突变的DNA样本,才出现杂交点,即使只有一个碱基不配对,也不可能形 成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列,同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受 检的DNA样本只能与突变ASO探针,不与正常ASO探针杂交,说明受检二条染色体上的基 因都发生这种突变,为突变纯合子;如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交, 说明一条染色体上的基因发生突变,另一条染色体上为正常基因,为这种突变基因的杂合子; 如果只能与正常ASO探针杂交,不能与突变ASO杂交,说明受检者不存在该种突变基因, 如图21-1所示。 若与PCR方法联合应用,即 PCR/ASO探针杂交法( PCR/ASO probe hybridization),是 种检测基因点突变的简便方法,先用PCR方法扩增突变点上下游的序列,扩增产物再与ASO 探针杂交,可明确诊断突变的纯合子和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病,如地中 海贫血、苯丙酮尿症等纯合子和杂合子的诊断很方便。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如 p53的点突变。 3)单链构象多态性( single strand conformation polymorphism,SSCP)分析相同长度的单 链DNA因其序列不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不尽相同,在非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳时速度就不同,若单链DNA用放射性核素标记,显影后即可区分电泳条带。一般先设 计引物对突变点所在外显子进行扩增,PCR产物经变性成单链后进行电泳分析。 PCR/SSCP方
2 基因诊断是以核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应（PCR） 为核心发展起来的多种方法，同时配合 DNA 序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为 一种很有用的基因诊断方法。 1. DNA 诊断 常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。 ⑴ 斑点杂交：根据待测 DNA 样本与标记的 DNA 探针杂交的图谱，可以判断目标基因 或相关的 DNA 片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。 ⑵ 等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe）杂交： 是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约 19 个核苷酸 长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交 条件下，只有该点突变的 DNA 样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形 成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受 检的 DNA 样本只能与突变 ASO 探针，不与正常 ASO 探针杂交，说明受检二条染色体上的基 因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变 ASO 探针又能与正常 ASO 探针杂交， 说明一条染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子； 如果只能与正常 ASO 探针杂交，不能与突变 ASO 杂交，说明受检者不存在该种突变基因， 如图 21-1 所示。 若与 PCR 方法联合应用，即 PCR/ASO 探针杂交法(PCR/ASO probe hybridization)，是一 种检测基因点突变的简便方法，先用 PCR 方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与 ASO 探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中 海贫血、苯丙酮尿症等纯合子和杂合子的诊断很方便。也可分析癌基因如 H-ras 和抑癌基因如 p53 的点突变。 ⑶ 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP）分析相同长度的单 链 DNA 因其序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳时速度就不同，若单链 DNA 用放射性核素标记，显影后即可区分电泳条带。一般先设 计引物对突变点所在外显子进行扩增，PCR 产物经变性成单链后进行电泳分析。PCR/SSCP 方
法,能快速、灵敏、有效地检测DNA突变点,如图21-2,此法可用检测点突变的遗传疾病, 如苯丙酮尿症、血友病等,以及点突变的癌基因和抑癌基因 (4)限制性内切酶图谱( restriction map)分析,如果DNA突变后改变了某一核酸限制性 内切酶的识别位点,使原来某一识别位点消失,或形成了新的识别位点,那么相应限制性内 切酶片段的长度和数目会发生改变。一般基因组DNA经该种限制性内切酶水解,再做 Southern 印迹,根据杂交片段的图谱,可诊断该点突变,如图21-3所示。如果用PCR扩增该突变点的 外显子,PCR产物经该种酶消化后,进行琼脂糖电泳,溴乙锭染色后可直接观察片段的大小 及数目。此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传疾病,如镰状细胞贫血。或 基因缺失的疾病如α地中海贫血症,单纯性生长激素缺乏症等。 (5)限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism,RFLP)遗传连锁分 析人群中个体间DNA的序列存在差异,据估计每100-200个核苷酸中便有1个发生突变,这 种现象称为DNA多态性。有些DNA多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点,因而产生 了DNA限制性片段长度多态性。RFLP按孟德尔方式遗传,在某一特定的家庭中,如果某一 致病基因与特定的多态性片段连锁,可以遗传给子代,因此这一多态性片段可作为遗传标记 来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因,见图21-4,此法可用于诊断甲型 血友病、苯丙酮尿症、享延顿舞蹈病等 (6)DNA序列分析对致病有关的DNA片段进行序列测定,是诊断基因异常(已知和未知) 最直接和准确的方法 2.RNA诊断 RNA诊断主要是分析基因的表达功能,检测转录物的质和量,以判断基因转录效率的高 低,以及转录物的大小 (1)RNA印迹( Northern blot)RNA印迹是检测基因是否表达,表达产物mRNA的大小的 可靠方法,根据杂交条带的强度,可以判断基因表达的效率。 (2)RI-PCR是一种检测基因表达产物mRNA灵敏的方法,若与荧光定量PCR结合可对 RT-PCR产物量进行准确测定 三.基因诊断的应用
3 法，能快速、灵敏、有效地检测 DNA 突变点，如图 21-2，此法可用检测点突变的遗传疾病， 如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基因和抑癌基因。 ⑷ 限制性内切酶图谱（restriction map）分析，如果 DNA 突变后改变了某一核酸限制性 内切酶的识别位点，使原来某一识别位点消失，或形成了新的识别位点，那么相应限制性内 切酶片段的长度和数目会发生改变。一般基因组 DNA 经该种限制性内切酶水解，再做 Southern 印迹，根据杂交片段的图谱，可诊断该点突变，如图 21-3 所示。如果用 PCR 扩增该突变点的 外显子，PCR 产物经该种酶消化后，进行琼脂糖电泳，溴乙锭染色后可直接观察片段的大小 及数目。此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传疾病，如镰状细胞贫血。或 基因缺失的疾病如α地中海贫血症，单纯性生长激素缺乏症等。 ⑸ 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP）遗传连锁分 析人群中个体间 DNA 的序列存在差异，据估计每 100-200 个核苷酸中便有 1 个发生突变，这 种现象称为 DNA 多态性。有些 DNA 多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生 了 DNA 限制性片段长度多态性。RFLP 按孟德尔方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某一 致病基因与特定的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这一多态性片段可作为遗传标记， 来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因，见图 21-4，此法可用于诊断甲型 血友病、苯丙酮尿症、享延顿舞蹈病等。 ⑹ DNA 序列分析对致病有关的 DNA 片段进行序列测定，是诊断基因异常（已知和未知） 最直接和准确的方法。 2. RNA 诊断 RNA 诊断主要是分析基因的表达功能，检测转录物的质和量，以判断基因转录效率的高 低，以及转录物的大小。 ⑴RNA 印迹（Northern blot）RNA 印迹是检测基因是否表达，表达产物 mRNA 的大小的 可靠方法，根据杂交条带的强度，可以判断基因表达的效率。 ⑵RT-PCR 是一种检测基因表达产物 mRNA 灵敏的方法，若与荧光定量 PCR 结合可对 RT-PCR 产物量进行准确测定。 三. 基因诊断的应用
(一)遗传疾病 现知遗传疾病有数千种,但多数遗传疾病属少见病例,有些遗传疾病在不同民族,不同 地区的人群中发病率不同,例如镰状细胞贫血( sickle cell anemia),非洲黑色人种发病率高, 而囊性纤维化症( cystic fibrosis)常见于美国白色人种,这二种遗传疾病在我国为罕见病例。 中国较常见的遗传疾病有地中海贫血、甲型血友病、乙型血友病、苯丙酮尿症、杜氏肌营养 不良症(DMD)、葡萄糖-6磷酸脱氢酶(G-6PD)缺乏症、唐氏综合症(Dow' syndrome) 等 根据不同遗传疾病的分子基础,可采用不同的技术方法进行诊断,不但可对有症状患者 进行检测,而且对遗传疾病家族中未发病的成员乃至胎儿甚至胚胎着床前( preimplantation) 进行诊断是否携带有异常基因,这对婚育具有指导意义 地中海贫血(地贫)是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传疾病( monogenIc disease),由于一种或几种珠蛋白合成障碍导致a类与β类珠蛋白不平衡造成的,临床以贫血 黄疸、肝脾肿大及特殊外貌为特征,地贫最常见的有两类:α地贫和β地贫。 α地贫(a- thalassemias)的分子基础主要为α珠蛋白基因缺失,也有部分病例是由于碱基 突变造成的。可采用限制性内切酶图谱方法检测a珠蛋白基因的缺失 人a珠蛋白基因簇位于16号染色体,长度29kb,包含7个连锁的a类基因或假基因。 α基因(α1及α2编码序列相同,仅非编码序列稍有差别,产物相同),该基因簇上有2个 Eco RI 识别位点,经 EcoRI酶解,进行 Southem印迹,用标记的a基因片段作探针,得到一条23kl 的杂交条带,BmH识别位点有4个,但只有14kb片段能与mRNA基因探针杂交,见图21-5。 Hb bart’s胎儿水肿综合征:由于该病患儿二条16号染色体的4个α珠蛋白基因均缺失, 不能合成α链,胎儿全身水肿、肝脾肿大、四肢短小,常于妊娠30-40周死亡或早产后半小 时内死亡。样本DNA经限制性内切酶图谱分析不能显示a珠蛋白基因区带,RNA诊断也测 定不出有a珠蛋白基因的mRNA。 缺失型HBH病:由于一条16号染色体上的两个a珠蛋白基因均缺失,另一条16号染色 体上则缺失一个α珠蛋白基因,并缺失3.7k长度的DNA片段(右侧缺失型)或42kb片段 (左侧缺失型),DNA诊断只产生19kb长度的 EcoRI片段,或10 kb bamh片段
4 （一）遗传疾病 现知遗传疾病有数千种，但多数遗传疾病属少见病例，有些遗传疾病在不同民族，不同 地区的人群中发病率不同，例如镰状细胞贫血（sickle cell anemia）,非洲黑色人种发病率高， 而囊性纤维化症（cystic fibrosis）常见于美国白色人种，这二种遗传疾病在我国为罕见病例。 中国较常见的遗传疾病有地中海贫血、甲型血友病、乙型血友病、苯丙酮尿症、杜氏肌营养 不良症（DMD）、葡萄糖-6 磷酸脱氢酶（G-6PD）缺乏症、唐氏综合症（Down’s syndrome） 等。 根据不同遗传疾病的分子基础，可采用不同的技术方法进行诊断，不但可对有症状患者 进行检测，而且对遗传疾病家族中未发病的成员乃至胎儿甚至胚胎着床前（preimplantation） 进行诊断是否携带有异常基因，这对婚育具有指导意义。 地中海贫血（地贫）是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传疾病（monogenic disease）,由于一种或几种珠蛋白合成障碍导致α类与β类珠蛋白不平衡造成的，临床以贫血、 黄疸、肝脾肿大及特殊外貌为特征，地贫最常见的有两类：α地贫和β地贫。 α地贫(α-thalassemias)的分子基础主要为α珠蛋白基因缺失，也有部分病例是由于碱基 突变造成的。可采用限制性内切酶图谱方法检测α珠蛋白基因的缺失。 人α珠蛋白基因簇位于 16 号染色体，长度 29 kb，包含 7 个连锁的α类基因或假基因。 α基因（α1 及α2 编码序列相同，仅非编码序列稍有差别,产物相同），该基因簇上有 2 个 EcoRI 识别位点，经 EcoRI 酶解，进行 Southern 印迹，用标记的α基因片段作探针，得到一条 23 kb 的杂交条带，BamHI 识别位点有 4 个，但只有 14 kb 片段能与 mRNA 基因探针杂交，见图 21-5。 Hb Bart’s 胎儿水肿综合征：由于该病患儿二条 16 号染色体的 4 个α珠蛋白基因均缺失， 不能合成α链，胎儿全身水肿、肝脾肿大、四肢短小，常于妊娠 30－40 周死亡或早产后半小 时内死亡。样本 DNA 经限制性内切酶图谱分析不能显示α珠蛋白基因区带，RNA 诊断也测 定不出有α珠蛋白基因的 mRNA。 缺失型 HBH 病：由于一条 16 号染色体上的两个α珠蛋白基因均缺失，另一条 16 号染色 体上则缺失一个α珠蛋白基因，并缺失 3.7 kb 长度的 DNA 片段（右侧缺失型）或 4.2 kb 片段 （左侧缺失型），DNA 诊断只产生 19 kb 长度的 EcoRI 片段，或 10kb BamHI 片段
标准型a地贫:一条16号染色体上2个a珠蛋白基因全部缺失。而另一条16号染色体 上具有2个正常的a珠蛋白基因,DNA诊断结果, EcoRI和BamH都出现与正常一样的23kb 或14kb的条带,但杂交条带的放射性自显影较正常人浅。 β地贫(β thalassemias)的基因诊断:β地贫的分子基础不同于a地贫,β珠蛋白基因通 常并不缺失,而是由于基因点突变或个别碱基的插入或缺失。每一民族和人群β珠蛋白基因 点突变部位不尽相同,都有特定的类型谱。 (二)感染性疾病 过去对感染性疾病( infectious diseases)的诊断,一是直接分离检查病原体,或者对患者血 清学或生物化学的分析。有些病原体不容易分离,有些需经过长期培养才能获得。血清学对 病原体抗体的检测虽然很方便,但是病原体感染人体后需要间隔一段时间后才出现抗体,并 且血清学检査只能确定是否接触过该种病原体,但不能确定是否有现行感染,对潜伏病原体 的检查有困难 对感染性疾病的基因诊断具有快速、灵敏、特异等优点。80年代建立的PCR技术已广泛 应用于对病原体的检测。一般根据各病原体特异和保守的序列设计引物,有的还合成ASO探 针,对病原体的DNA可用PCR技术直接检查,而对RNA病毒,则采用 RT-PCR。现在市场 已经有许多种病原体的测定药盒供应,每一盒包含扩增某种病原体的特异引物,所需的酶以 及配妥的各种反应试剂,并附有可行的操作方法步骤 1.病毒性感染: 多种病毒性感染都可采用基因诊断检测相应的病原体,如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎 病毒,人免疫缺陷病毒、可萨奇病毒、脊髓灰质类病毒、腺病毒、EB病毒、疱疹病毒、人巨 细胞病毒、乳头状病毒……等。最近新发现的SARS冠状病毒,在基因组(RNA)序列确定 后,便很快建立了 RT-PCR的基因诊断法 2.细菌性感染: 可应用基因诊断检测多种致病性的细菌,如结核分枝杆菌、痢疾性大肠杆菌、霍乱弧菌 淋球菌、绿脓杆菌……等。 3.寄生虫:
5 标准型α地贫：一条 16 号染色体上 2 个α珠蛋白基因全部缺失。而另一条 16 号染色体 上具有 2 个正常的α珠蛋白基因，DNA 诊断结果，EcoRI 和 BamHI 都出现与正常一样的 23 kb 或 14 kb 的条带，但杂交条带的放射性自显影较正常人浅。 β地贫(β-thalassemias)的基因诊断：β地贫的分子基础不同于α地贫，β珠蛋白基因通 常并不缺失，而是由于基因点突变或个别碱基的插入或缺失。每一民族和人群β珠蛋白基因 点突变部位不尽相同，都有特定的类型谱。 （二）感染性疾病 过去对感染性疾病(infectious diseases)的诊断，一是直接分离检查病原体，或者对患者血 清学或生物化学的分析。有些病原体不容易分离，有些需经过长期培养才能获得。血清学对 病原体抗体的检测虽然很方便，但是病原体感染人体后需要间隔一段时间后才出现抗体，并 且血清学检查只能确定是否接触过该种病原体，但不能确定是否有现行感染，对潜伏病原体 的检查有困难。 对感染性疾病的基因诊断具有快速、灵敏、特异等优点。80 年代建立的 PCR 技术已广泛 应用于对病原体的检测。一般根据各病原体特异和保守的序列设计引物，有的还合成 ASO 探 针，对病原体的 DNA 可用 PCR 技术直接检查，而对 RNA 病毒，则采用 RT-PCR。现在市场 已经有许多种病原体的测定药盒供应，每一盒包含扩增某种病原体的特异引物，所需的酶以 及配妥的各种反应试剂，并附有可行的操作方法步骤。 1. 病毒性感染： 多种病毒性感染都可采用基因诊断检测相应的病原体，如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎 病毒，人免疫缺陷病毒、可萨奇病毒、脊髓灰质类病毒、腺病毒、EB 病毒、疱疹病毒、人巨 细胞病毒、乳头状病毒……等。最近新发现的 SARS 冠状病毒，在基因组（RNA）序列确定 后，便很快建立了 RT-PCR 的基因诊断法。 2. 细菌性感染： 可应用基因诊断检测多种致病性的细菌，如结核分枝杆菌、痢疾性大肠杆菌、霍乱弧菌、 淋球菌、绿脓杆菌……等。 3. 寄生虫：
恶性疟原虫、克鲁斯锥虫、利什曼原虫、血吸虫、弓形虫……等都有基因诊断的方法 4.其它:如衣原体、支原体、真菌性感染也均用基因诊断 (三)恶性肿瘤 分析一些原癌基因的点突变、插入突变、基因扩增、染色体易位和抑癌基因的丢失或突 变,可以了解恶性肿瘤的分子机制,有助于对恶性肿瘤的诊断,对肿瘤治疗及预后有指导意 (四)法医学中的应用 对生物个体识别和亲子鉴定传统的方法有血型、血清蛋白型、红细胞酶型和白细胞膜抗 原(HLA)等,但这些方法都存在着一些不确定的因素。近年来对人基因结构的深入研究发现, 有些具有个体特征的遗传标记可用于个体识别和亲子鉴定 1.DNA指纹分析( DNA fingerprinting) 近年研究发现,人类基因组中许多位点存在着一种可变串联重复序列( variable number of tandem repeat,NTR)。这种VNIR主要存在于基因的非编码区,重复序列是头对尾串联排列 着。人类某些ⅤNTR是由20-50个重复单位组成,每个单位含15-100bp,DNA的长度为1kb 至5kb,较普通卫星DNA(约100kb)小,所以称为小卫星DNA( minisatellite dna)。经研 究发现NTR有高度的多态性,在人群中的分布表现高度的个体特异性,甚至同一个体同源 染色体的等位ⅤNTR的重复单位数也不同,等位基因按孟德尔方式遗传。VNTR区的重复单 位数目不同,所以该区的DNA长度不同。但每一位点VNTR的核心序列却有高度的保守性, 因此可认为ⅤNTR是一种判断个体的遗传标记 1985年, Jeffreys根据VNTR的特点,选择某些核心序列作为探针,并选用核心序列无 切割位点的限制性内切酶如Hint1,对DNA样品进行酶解,然后作 Southern印迹。图谱显示 不同个体具有不同条带,如同人的指纹具有高度的个体特异性一样,因此把这种 Southern印 迹图称作DNA指纹图谱 DNA fingerprint,如图21-6所示。实验证明,除同卵双生子有相同 的图谱外,两个人不可能有完全相同的图谱,所以这种方法对个体识别,亲子鉴定,嫌疑罪 犯的判断准确可靠。图21-7是引自文献报道的结果。可是 Southen印迹技术操作繁琐,所需 时间长,需要DNA量较大,若DNA降解还会影响对结果的判断。所以, Jeffreys又根据每一
6 恶性疟原虫、克鲁斯锥虫、利什曼原虫、血吸虫、弓形虫……等都有基因诊断的方法 4. 其它:如衣原体、支原体、真菌性感染也均用基因诊断。 （三）恶性肿瘤 分析一些原癌基因的点突变、插入突变、基因扩增、染色体易位和抑癌基因的丢失或突 变，可以了解恶性肿瘤的分子机制，有助于对恶性肿瘤的诊断，对肿瘤治疗及预后有指导意 义。 (四)法医学中的应用 对生物个体识别和亲子鉴定传统的方法有血型、血清蛋白型、红细胞酶型和白细胞膜抗 原(HLA)等，但这些方法都存在着一些不确定的因素。近年来对人基因结构的深入研究发现， 有些具有个体特征的遗传标记可用于个体识别和亲子鉴定。 1. DNA 指纹分析(DNA fingerprinting) 近年研究发现，人类基因组中许多位点存在着一种可变串联重复序列(variable number of tandem repeat，VNTR)。这种 VNTR 主要存在于基因的非编码区，重复序列是头对尾串联排列 着。人类某些 VNTR 是由 20-50 个重复单位组成，每个单位含 15-100 bp，DNA 的长度为 1kb 至 5kb，较普通卫星 DNA（约 100 kb）小，所以称为小卫星 DNA（minisatellite DNA）。经研 究发现 VNTR 有高度的多态性，在人群中的分布表现高度的个体特异性，甚至同一个体同源 染色体的等位 VNTR 的重复单位数也不同，等位基因按孟德尔方式遗传。VNTR 区的重复单 位数目不同，所以该区的 DNA 长度不同。但每一位点 VNTR 的核心序列却有高度的保守性， 因此可认为 VNTR 是一种判断个体的遗传标记。 1985 年， Jeffreys 根据 VNTR 的特点，选择某些核心序列作为探针，并选用核心序列无 切割位点的限制性内切酶如 Hinf1，对 DNA 样品进行酶解，然后作 Southern 印迹。图谱显示 不同个体具有不同条带，如同人的指纹具有高度的个体特异性一样，因此把这种 Southern 印 迹图称作 DNA 指纹图谱(DNA fingerprint)，如图 21-6 所示。实验证明，除同卵双生子有相同 的图谱外，两个人不可能有完全相同的图谱，所以这种方法对个体识别，亲子鉴定，嫌疑罪 犯的判断准确可靠。图 21-7 是引自文献报道的结果。可是 Sourthern 印迹技术操作繁琐，所需 时间长，需要 DNA 量较大，若 DNA 降解还会影响对结果的判断。所以，Jeffreys 又根据每一
VNTR区翼侧保守序列设计引物,用PCR方法对该区进行扩增,因ⅤNTR长度不同,所以产 物经琼脂糖凝胶电泳,染色后,根据条带的不同,可以判断结果。这种方法既方便又省时, 对部分酶解DNA也适用,对单根毛发,血斑,皮屑和精迹都可进行分析。但有些ⅤNTR重复 片断较长,PCR难以扩增。 2.短串联重复(short tandem repeat,STR)多态性分析 90年代初,发现人基因组中存在着数量众多的STR,STR的重复单元较短,核心序列含 2-4bp,DNA片段长度为100-500bp,故称为微卫星DNA( microsatellite dNA)与ⅤNIR相同 有不少的微卫星DNA存在着个体间重复单元数目不同的多态性,所以是一种应用价值很高的 遗传标记。又因为微卫星DNA较短,易进行PCR操作,也能适用于降解的DNA分析。目前, STR-PCR技术在法医学中的应用己占主导地位。 VNTR和STR除在法医学中的应用外,还用于遗传作图,基因定位及遗传疾病的诊断等。 第二节基因治疗 基因治疗的慨念 (一)基因治疗的定义 从基因角度可以理解为对缺陷的基因进行修复或将正常有功能的基因置换或增补缺陷基 因的方法。若从治疗角度可以广义地说是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达 从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。导入的基因可以是与缺陷基因相对应的有功能的 同源基因或与缺陷基因无关的治疗基因 基因治疗有两种形式,一种是改变体细胞的基因表达,即体细胞基因治疗( somatic gene therapy),另一种是改变生殖细胞的基因表达,即种系基因治疗( germline gene therapy),从理 论上讲,若对缺陷的生殖细胞进行矫正,不但当代可以得到根治,而且可以将正常的基因传 给子代。但生殖的生物学极其复杂,且尚未清楚,一旦发生差错将给人类带来不可想象的后 果,涉及一系列伦理学的问题,目前还不能用于人类。在现有的条件下,基因治疗仅限于体 细胞,基因型的改变只限于某一类体细胞,其影响只限于某个体的当代 (二)基因治疗的方式 基因治疗的方式( type of gene therapy)主要有3类,一类为基因矫正或置换,即对缺陷
7 VNTR 区翼侧保守序列设计引物，用 PCR 方法对该区进行扩增，因 VNTR 长度不同，所以产 物经琼脂糖凝胶电泳，染色后，根据条带的不同，可以判断结果。这种方法既方便又省时， 对部分酶解 DNA 也适用，对单根毛发，血斑，皮屑和精迹都可进行分析。但有些 VNTR 重复 片断较长，PCR 难以扩增。 2． 短串联重复(short tandem repeat,STR)多态性分析 90 年代初，发现人基因组中存在着数量众多的 STR, STR 的重复单元较短，核心序列含 2-4 bp，DNA 片段长度为 100-500 bp，故称为微卫星 DNA (microsatellite DNA).与 VNTR 相同, 有不少的微卫星 DNA 存在着个体间重复单元数目不同的多态性, 所以是一种应用价值很高的 遗传标记。又因为微卫星 DNA 较短，易进行 PCR 操作，也能适用于降解的 DNA 分析。目前， STR-PCR 技术在法医学中的应用已占主导地位。 VNTR 和 STR 除在法医学中的应用外，还用于遗传作图, 基因定位及遗传疾病的诊断等。 第二节 基因治疗 一. 基因治疗的慨念 （一）基因治疗的定义 从基因角度可以理解为对缺陷的基因进行修复或将正常有功能的基因置换或增补缺陷基 因的方法。若从治疗角度可以广义地说是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达 从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。导入的基因可以是与缺陷基因相对应的有功能的 同源基因或与缺陷基因无关的治疗基因。 基因治疗有两种形式，一种是改变体细胞的基因表达，即体细胞基因治疗（somatic gene therapy），另一种是改变生殖细胞的基因表达，即种系基因治疗（germline gene therapy），从理 论上讲，若对缺陷的生殖细胞进行矫正，不但当代可以得到根治，而且可以将正常的基因传 给子代。但生殖的生物学极其复杂，且尚未清楚，一旦发生差错将给人类带来不可想象的后 果，涉及一系列伦理学的问题，目前还不能用于人类。在现有的条件下，基因治疗仅限于体 细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞，其影响只限于某个体的当代。 （二）基因治疗的方式 基因治疗的方式（type of gene therapy）主要有 3 类，一类为基因矫正或置换，即对缺陷
基因的异常序列进行矫正,对缺陷基因精确地原位修复,或以正常基因原位置换异常基因, 因此不涉及基因组的任何改变,目前尚无体内成功的报道。另一类为基因增补,不去除异常 基因,而是通过外源基因的导入,使其表达正常产物,从而补偿缺陷基因的功能。再有一类 为基因封闭,有些基因异常过度表达,如癌基因或病毒基因可导致疾病,可用反义核酸技术、 核酶或诱饵( decoy)转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达。除上述3大类外,近日发 展其它多种形式,如导入病毒或细菌来源的所谓“自杀基因”或经过改造的条件性复制病毒, 只能在p53缺陷的肿瘤细胞繁殖以达到溶解肿瘤细胞。 (三)导入的方式 导入基因有两种方式,一种是体外导入( ex vIvo),即在体外将基因导入细胞内,再将这 种基因修饰过的细胞回输病人体内,使这种带有外源基因的细胞在体内表达,从而达到治疗 或预防的目的。被用于修饰的细胞可以是自体,同种异体或异种的体细胞。合适的细胞应易 于从体内取出和回输,能在体外増殖,经得起体外实验操作,能够高效表达外源基因,且能 在体内长期存活。目前常用的细胞有淋巴细胞、骨髓干细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、 肝细胞、肌细胞、角朊细胞( keratinocyte)、多种肿瘤细胞等。另一种是体内导入(iwvo), 即将外源基因直接导入体内有关的组织器官,使其进入相应的细胞并进行表达 二.外源治疗基因 无论是 ex vivo或 In 11o导入基因的方式,首先要选择合适的能达到治疗或预防用的目的 基因。如导入遗传疾病所缺陷的基因或增强机体免疫的细胞因子基因。目前用于临床试验的 治疗基因主要为该基因的cDNA。一些临床试验用的基因见表21-1 作为外源治疗基因的条件:基因的大小要根据所用载体( vector)能够运载的容量;若为 分泌性产物需含信号肽序列:cDNA序列应正确无误;翻译时要求有起始密码子及终止密码子。 三.载体系统 要有效将治疗基因导入人体细胞内需要靠合适的运送基因的工具,即载体( vector) 载体有两类:一类为病毒载体( viral vector),另一类为非病毒载体(non- viral vector) 目前临床636个基因治疗方案所用的载体列于表21-2 目前临床试验用的载体仍然以病毒载体居多,占70%以上,而逆转录病毒载体约占所用
8 基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因， 因此不涉及基因组的任何改变，目前尚无体内成功的报道。另一类为基因增补，不去除异常 基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。再有一类 为基因封闭，有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、 核酶或诱饵（decoy）转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达。除上述 3 大类外，近日发 展其它多种形式，如导入病毒或细菌来源的所谓“自杀基因”或经过改造的条件性复制病毒， 只能在 p53 缺陷的肿瘤细胞繁殖以达到溶解肿瘤细胞。 （三）导入的方式 导入基因有两种方式，一种是体外导入（ex vivo）,即在体外将基因导入细胞内，再将这 种基因修饰过的细胞回输病人体内，使这种带有外源基因的细胞在体内表达，从而达到治疗 或预防的目的。被用于修饰的细胞可以是自体，同种异体或异种的体细胞。合适的细胞应易 于从体内取出和回输，能在体外增殖，经得起体外实验操作，能够高效表达外源基因，且能 在体内长期存活。目前常用的细胞有淋巴细胞、骨髓干细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、 肝细胞、肌细胞、角朊细胞（keratinocyte）、多种肿瘤细胞等。另一种是体内导入（in vivo）， 即将外源基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。 二. 外源治疗基因 无论是 ex vivo 或 in vivo 导入基因的方式，首先要选择合适的能达到治疗或预防用的目的 基因。如导入遗传疾病所缺陷的基因或增强机体免疫的细胞因子基因。目前用于临床试验的 治疗基因主要为该基因的 c DNA。一些临床试验用的基因见表 21-1 作为外源治疗基因的条件：基因的大小要根据所用载体（vector）能够运载的容量；若为 分泌性产物需含信号肽序列；cDNA 序列应正确无误；翻译时要求有起始密码子及终止密码子。 三. 载体系统 要有效将治疗基因导入人体细胞内需要靠合适的运送基因的工具，即载体（vector）， 载体有两类：一类为病毒载体（viral vector ）,另一类为非病毒载体（non-viral vector） 目前临床 636 个基因治疗方案所用的载体列于表 21-2 目前临床试验用的载体仍然以病毒载体居多，占 70%以上，而逆转录病毒载体约占所用
全部载体的1/3。非病毒载体以脂质体居多,而裸质粒DNA的应用有逐渐上升的趋势。目前 所用的载体尚不尽人意,有些是存在着安全性问题,有些则为效率不高等缺点。下面将讨论 几类常用载体的构建极其优点。 (一)逆转录病毒载体 1.逆转录病毒载体的构建 逆转录病毒( retrovirus)属RNA病毒,通过其本身逆转录酶的作用,形成双链DNA原病毒, 然后整合于宿主细胞染色体中,详细的基因结构及生活史见第十三章。构建载体时以DNA原 病毒为基础,将野生型病毒的3类结构基因gqg,pol和em删除,以供外源基因的插入,但 是要保存病毒的包装序列(ψ)和双侧的长末端重复(LTR),LTR含有启动子、增强子、整 合信号及 poly A信号等多种元件插入的基因一般为两种或两种以上,一种为标记基因( marker gene)供阳性筛选,常用的为原核细胞的新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ,neσ基因),该酶能 破坏抗生素G418(新霉素的衍生物)的活性。哺乳动物细胞在含G418的培养液中不能生长 若含有neo"基因能产生NPTⅡ,即能在含有G418的培养液中生长,故便于筛选转导基因的 细胞 另一种为供治疗用的基因,治疗基因和标记基因可识别受控于不同启动子,其中一种受 逆转录病毒的LIR调控,另一种常需连接另外的启动子序列,或者连接一种称为内核糖体进 入位点序列(IRES),使转录成一条多顺反子mRNA,在翻译过程中IRES具有内启动作用 能启动蛋白质的合成,所以同一分子mRNA能合成2种或2种以上不同的蛋白质 如何包装成含有外源基因的逆转录病毒供治疗用的呢?因为载体本身的3类结构基因已 被删除,因此包装所需的结构蛋白质,需要靠一种所谓的包装细胞,如PA317,提供,这种细 胞含有一种缺失包装信号的逆转录病毒,只能产生包装所需的结构蛋白质,但本身的病毒RNA 因缺失包装信号所以不会被包装成病毒颗粒,这对治疗的安全性很重要,可避免产生有复制 潜能的逆转录病毒(RCR)。将上述所构建的载体转染包装细胞PA317,可产生供治疗用的含 有治疗基因的逆转录病毒颗粒,见图21-8,这种病毒能高效感染细胞,使治疗基因能够整合 至细胞的染色体中,从而能长期表达基因产物,以达到治疗目的 2.逆转录病毒载体的优缺点
9 全部载体的 1/3。非病毒载体以脂质体居多，而裸质粒 DNA 的应用有逐渐上升的趋势。目前 所用的载体尚不尽人意，有些是存在着安全性问题，有些则为效率不高等缺点。下面将讨论 几类常用载体的构建极其优点。 （一）逆转录病毒载体 1. 逆转录病毒载体的构建 逆转录病毒(retrovirus)属 RNA 病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链 DNA 原病毒, 然后整合于宿主细胞染色体中, 详细的基因结构及生活史见第十三章。构建载体时以 DNA 原 病毒为基础，将野生型病毒的 3 类结构基因 gag，pol 和 env 删除，以供外源基因的插入，但 是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR 含有启动子、增强子、整 合信号及 poly A 信号等多种元件。插入的基因一般为两种或两种以上，一种为标记基因（marker gene）供阳性筛选，常用的为原核细胞的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPT Ⅱ,neoR 基因），该酶能 破坏抗生素 G418（新霉素的衍生物）的活性。哺乳动物细胞在含 G418 的培养液中不能生长， 若含有 neoR基因能产生 NPT Ⅱ，即能在含有 G418 的培养液中生长，故便于筛选转导基因的 细胞。 另一种为供治疗用的基因，治疗基因和标记基因可识别受控于不同启动子，其中一种受 逆转录病毒的 LTR 调控，另一种常需连接另外的启动子序列，或者连接一种称为内核糖体进 入位点序列（IRES），使转录成一条多顺反子 mRNA，在翻译过程中 IRES 具有内启动作用， 能启动蛋白质的合成，所以同一分子 mRNA 能合成 2 种或 2 种以上不同的蛋白质。 如何包装成含有外源基因的逆转录病毒供治疗用的呢？因为载体本身的 3 类结构基因已 被删除，因此包装所需的结构蛋白质，需要靠一种所谓的包装细胞，如 PA317, 提供，这种细 胞含有一种缺失包装信号的逆转录病毒，只能产生包装所需的结构蛋白质，但本身的病毒 RNA 因缺失包装信号,所以不会被包装成病毒颗粒，这对治疗的安全性很重要，可避免产生有复制 潜能的逆转录病毒（RCR）。将上述所构建的载体转染包装细胞 PA317，可产生供治疗用的含 有治疗基因的逆转录病毒颗粒，见图 21-8，这种病毒能高效感染细胞，使治疗基因能够整合 至细胞的染色体中，从而能长期表达基因产物，以达到治疗目的。 2. 逆转录病毒载体的优缺点
最大的优点为能准确整合于宿主细胞的染色体中,所携带的外源目的基因及有关序列不 会发生重排,因而能长期稳定表达。感染细胞范围较广,感染率比较高,由于结构基因均被 删除,因此免疫原性较低。对感染细胞无毒性作用。可附加不同的调控元件来提高外源基因 的表达效率,并对之进行调控。 局限性:逆转录病毒只能在核膜尚未形成时,才能进入核内,因此它只能将外源基因转 移至增殖分裂的细胞,而对静止细胞转录效果不佳。由于该病毒基因本身不大,故能容纳外 源基因的大小有限,应小于8kb。逆转录病毒稳定性较差,难耐受体外的操作,在纯化或浓缩 过程常使其感染性降低。病毒颗粒能迅速被补体破坏。因为是随机整合,所以具有插入突变 的危险,特别是病毒制剂中污染着RCRa (二)其他病毒载体 1.腺病毒 感染人的腺病毒( adenovirus)有50余种血清型,能感染多种组织器官,产生类似感冒或类 似流感症状,目前多数采用无致病性的5型及2型腺病毒作为载体。构建载体时IR及包装 信号应保存,其余的部分有些可删除,供外源基因的插入,插入片段的大小可达8kb。腺病毒 载体较稳定,能耐受纯化浓缩等操作,可获得髙滴度的病毒颗粒,感染宿主细胞范围较广,感 染效率高,既能感染分裂相细胞,也能感染非分裂相细胞,但腺病毒不整合于宿主细胞染色体 故只能短暂表达外源基因,最大的缺点为引起机体的免疫反应和毒副作用 腺相关病毒 属微小病毒科,不致病,为单链DNA约47kb,腺相关病毒( adeno- associated virus),作 为载体最大的优点能感染分裂相和非分裂相细胞,并整合于宿主细胞染色体,能长期稳定表 达,无不良反应,适合于一些遗传性疾病如甲型和乙型血友病的基因治疗。但腺相关病毒载 体的制备因需要辅助病毒的参与,有污染的可能性。 3.其他 慢病毒(如H)、Ⅰ型单纯性疱疹病毒、痘病毒和杄状病毒等都被硏究发展作为转移基 因的载体。 (三)脂质体
10 最大的优点为能准确整合于宿主细胞的染色体中，所携带的外源目的基因及有关序列不 会发生重排，因而能长期稳定表达。感染细胞范围较广，感染率比较高，由于结构基因均被 删除，因此免疫原性较低。对感染细胞无毒性作用。可附加不同的调控元件来提高外源基因 的表达效率，并对之进行调控。 局限性：逆转录病毒只能在核膜尚未形成时，才能进入核内，因此它只能将外源基因转 移至增殖分裂的细胞，而对静止细胞转录效果不佳。由于该病毒基因本身不大，故能容纳外 源基因的大小有限，应小于 8kb。逆转录病毒稳定性较差，难耐受体外的操作，在纯化或浓缩 过程常使其感染性降低。病毒颗粒能迅速被补体破坏。因为是随机整合，所以具有插入突变 的危险，特别是病毒制剂中污染着 RCR。 （二）其他病毒载体 1. 腺病毒 感染人的腺病毒(adenovirus)有 50 余种血清型，能感染多种组织器官，产生类似感冒或类 似流感症状，目前多数采用无致病性的 5 型及 2 型腺病毒作为载体。构建载体时 ITR 及包装 信号应保存，其余的部分有些可删除，供外源基因的插入，插入片段的大小可达８kb。腺病毒 载体较稳定，能耐受纯化浓缩等操作，可获得高滴度的病毒颗粒，感染宿主细胞范围较广，感 染效率高，既能感染分裂相细胞，也能感染非分裂相细胞，但腺病毒不整合于宿主细胞染色体， 故只能短暂表达外源基因，最大的缺点为引起机体的免疫反应和毒副作用。 ２. 腺相关病毒 属微小病毒科，不致病，为单链 DNA 约 4.7 kb，腺相关病毒(adeno-associated virus)，作 为载体最大的优点能感染分裂相和非分裂相细胞，并整合于宿主细胞染色体，能长期稳定表 达，无不良反应，适合于一些遗传性疾病如甲型和乙型血友病的基因治疗。但腺相关病毒载 体的制备因需要辅助病毒的参与，有污染的可能性。 ３. 其他 慢病毒（如 HIV）、Ｉ型单纯性疱疹病毒、痘病毒和杆状病毒等都被研究发展作为转移基 因的载体。 （三）脂质体