微生物与感染 Journalof microbes and Infections, December25,2015,10(6)365-370 致病菌的分离与鉴定”一直是教学内容的重点和难系,让基础医学教学与临床医学实践更紧密地联系 点。但是,随着国家《病原微生物实验室生物安全管起来。同时,由于标本来自于正常人体,达到了病原 理条例》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌微生物实验室生物安全管理的要求。 (毒)种或样本运输管理规定》等相关实验室生物安 全法律法规的出台,志贺菌、伤寒沙门菌等重要肠道 材料与方法 致病菌实验均不能在教学实验室内进行,制约了《医1.1教学对象 本教研室就开始对本科生细菌学的实验教学内容进制本科生其中女同学26名,男同学10名六车 学微生物学》教学实验的开展。因此,从2006年起 复旦大学2011级和2012级临床医学专业 行改革,在以往实验教学的基础上重新设计和开12教学材料、教学安排及教学实验结果 展综合性实验教学活动——“人体肠道杆菌的分离12.1标本来源普通粪便标本12份,由学生自 与鉴定”,通过分离与鉴定正常人体肠道杆菌的过己采集提供,置甘油保存液中备用。 程,让学生系统地学习并理解传统的细菌分离纯化1.2.2材料与试剂API10s革兰阴性细菌生化 和生化鉴定方法。从2013年起,又逐步在该系统实反应鉴定条购自生物梅里埃中国有限公司,麦康凯 验中引入现代分子生物学的l6 SrrNA基因序列分和普通琼脂培养基购自上海疾病预防控制中心,细 析技术和方法,并在小班教学(每班20人左右)中加菌基因组提取试剂盒聚合酶链反应( polymerase 以实施。通过比较两种菌种鉴定方法的各自特点, chain reaction,PCR)扩增试剂盒(Taq)、TA克隆 增强了学生分析和解决问题的能力,更新了知识体试剂盒、琼脂糖凝胶等购自生工生物工程(上海) 表1肠道杄菌16 S rRNA通用扩增引物序列 Tab. 1 The universal primers for enterobacteriaceae 16s rRNA Primer Size of PCR product 16S rRNA-27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG About 1, 45 kb 16S rRNA-1492R GGTTACCTTGTTACGACTT 表2实验安排 Tab 2 Arrangement of experiment 第9教学周 学习粪便标本的采集、保存和运输方法,采集普通粪便标本12份,并置于甘油保存液中保存备用 第10教学周 麦康凯平板上分区划线接种粪便标本,置37℃培养16~18h后于4℃冷库保存备用 第11教学周 观察并记录麦康凯平板上菌落的特征,从中选取单个菌落进行革兰染色,同时取该单个菌落接种于 液体培养基增菌,培养物于4℃冷库保存备用 第12教学周 (1)制备实验要求密度的待检细菌悬液并接种于API10S革兰阴性细菌生化反应鉴定条,于37℃ 培养16~18h后置4℃冷库保存1周备用 (2)K-B纸片扩散法药敏试验测定待检细菌对4种抗生素(卡那霉素、庆大霉素、链霉素和复合磺 胺)的耐药性 (3)制备待检细菌基因组并作为16 OS rrnA扩增模板,用16 S rrNA-27F和16 S TRNA-1492R引物 扩增待检细菌16 SrrNA27~142核苷酸片段。PCR反应体系为:总体积20l,含1×PCR Buffer,1mmol/LMg2、1 mmol/L dNTPs、1mo引物、50ng模板DNA及05U7ag DNA聚合酶。反应条件:94℃预变性;94℃30s、55℃30s、72℃90s30个循环;72℃延长 7min。产物经1%凝胶电泳鉴定 (4)PCR产物经纯化、TA克隆后,送铂尚生物技术(上海)有限公司进行核苷酸序列分析 第13教学周 (1)观察并记录生化反应结果,并依据试剂盒判定方法和判断标准进行鉴定 (2)生化鉴定结果与测序鉴定结果比对分析 (3)观察并记录药敏试验结果致病菌的分离与鉴定”一直是教学内容的重点和难 点 。 但是 ，随着国家枟病原微生物实验室生物安全管 理条例枠和枟可感染人类的高致病性病原微生物菌 （毒）种或样本运输管理规定枠等相关实验室生物安 全法律法规的出台 ，志贺菌 、伤寒沙门菌等重要肠道 致病菌实验均不能在教学实验室内进行 ，制约了枟医 学微生物学枠教学实验的开展 。 因此 ，从 2006 年起 ， 本教研室就开始对本科生细菌学的实验教学内容进 行改革［4］ ，在以往实验教学的基础上重新设计和开 展综合性实验教学活动 ——— “人体肠道杆菌的分离 与鉴定” ，通过分离与鉴定正常人体肠道杆菌的过 程 ，让学生系统地学习并理解传统的细菌分离纯化 和生化鉴定方法 。 从 2013 年起 ，又逐步在该系统实 验中引入现代分子生物学的 16S rRNA 基因序列分 析技术和方法 ，并在小班教学（每班 20 人左右）中加 以实施 。 通过比较两种菌种鉴定方法的各自特点 ， 增强了学生分析和解决问题的能力 ，更新了知识体 系 ，让基础医学教学与临床医学实践更紧密地联系 起来 。 同时 ，由于标本来自于正常人体 ，达到了病原 微生物实验室生物安全管理的要求［3‐5 ］ 。 1 材料与方法 1 ．1 教学对象 复旦大学 2011 级和 2012 级临床医学专业六年 制本科生 ，其中女同学 26 名 ，男同学 10 名 。 1 ．2 教学材料 、教学安排及教学实验结果 1 ．2 ．1 标本来源 普通粪便标本 12 份 ，由学生自 己采集提供 ，置甘油保存液中备用 。 1 ．2 ．2 材料与试剂 API 10S 革兰阴性细菌生化 反应鉴定条购自生物梅里埃中国有限公司 ，麦康凯 和普通琼脂培养基购自上海疾病预防控制中心 ，细 菌基因组提取试剂盒 、聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR）扩增试剂盒（ Taq） 、TA 克隆 试剂盒 、琼脂糖凝胶等购自生工生物工程（上海）有 表 1 肠道杆菌 16S rRNA 通用扩增引物序列 Tab ．1 The universal primers for enterobacteriaceae 16S rRNA Primer Sequence （5′‐3′） Size of PCR product 16S rRNA‐27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 16S rRNA‐1492R GGTTACCTTGTTACGACTT About 1 ．45 kb a 表 2 实验安排 Tab ．2 Arrangement of experiment 第 9 教学周 学习粪便标本的采集 、保存和运输方法 ，采集普通粪便标本 12 份 ，并置于甘油保存液中保存备用 第 10 教学周 麦康凯平板上分区划线接种粪便标本 ，置 37 ℃ 培养 16 ～ 18 h 后于 4 ℃ 冷库保存备用 第 11 教学周 观察并记录麦康凯平板上菌落的特征 ，从中选取单个菌落进行革兰染色 ，同时取该单个菌落接种于 LB 液体培养基增菌 ，培养物于 4 ℃ 冷库保存备用 第 12 教学周 （1） 制备实验要求密度的待检细菌悬液并接种于 API 10S 革兰阴性细菌生化反应鉴定条 ，于 37 ℃ 培养 16 ～ 18 h 后置 4 ℃ 冷库保存 1 周备用 （2） K‐B 纸片扩散法药敏试验测定待检细菌对 4 种抗生素（卡那霉素 、庆大霉素 、链霉素和复合磺 胺）的耐药性 （3） 制备待检细菌基因组并作为 16S rRNA 扩增模板 ，用 16S rRNA‐27F 和 16S rRNA‐1492R 引物 扩增待检细菌 16S rRNA 27 ～ 1 492核苷酸片段 。 PCR 反应体系为 ：总体积 20 μl ，含 1 × PCR Buffer 、1 mmol／L Mg 2 ＋ 、1 mmol／L dNTPs 、1 μmol／L 引物 、50 ng 模板 DNA 及0 ．5 U Taq DNA 聚合酶 。 反应条件 ：94 ℃ 预变性 ；94 ℃ 30 s 、55 ℃ 30 s 、72 ℃ 90 s ，30 个循环 ；72 ℃ 延长 7 min 。 产物经 1％ 凝胶电泳鉴定 （4） PCR 产物经纯化 、TA 克隆后 ，送铂尚生物技术（上海）有限公司进行核苷酸序列分析 第 13 教学周 （1） 观察并记录生化反应结果 ，并依据试剂盒判定方法和判断标准进行鉴定 （2） 生化鉴定结果与测序鉴定结果比对分析 （3） 观察并记录药敏试验结果 · 366 · 微生物与感染 Journal of Microbes and Infections ，December 25 ，2015 ，10（6） ：365‐370