a.配制40m1% Agrose溶液:称取 Agrose049,放入250m烧瓶中,加入40m1xTAE溶 液,置微波炉中大火加热1mn左右,沸腾后打开炉门,轻轻摇晃瓶身,待气泡消失后重新 加热5s,再次沸腾后摇晃瓶身,重复3次,至溶解均匀完全。 b.放置电泳板于水平桌面上,插上梳子。待 Agrose溶液冷却至50℃C左右时,加入EB溶液 (10mg/m)2μl,摇晃瓶身使之混匀,立即浇板,水平桌面上静置待凝。 C.胶凝后轻轻拔去梳子,放入电泳槽,向槽中加入1xTAE至浸没凝胶。 d.上样:依次按如下样品混匀,向上样孔内加样并标记为AB,C A孔:5μ Marker(0.1pg/u)+1p6 lOading Buffer B孔:10叫抽提出的pBR322重组质粒DNA含14 kb c-myc基因)+2pl6× Loading uffer C孔:20μ酶切产物+4pl6 LOading Buffer; e,电泳:盖上电泳槽盖,接通电源,加样孔位于负极,在5Vcm电压下电泳,待溴酚蓝跑 到凝胶12处停止电泳。 f.紫外灯下观察结果并拍照留档 实验结果 DNA重组与细胞转化(Fig1Fig2) 培养基内转化组(Fig1)和阳性对照组(Fig2)均有菌落生长,转化组培养基上的菌落数量 明显多于阳性对照组。转化组的菌落数约为250个,而阳性对照组培养基上生长的菌落数 约为20个。转化组的菌落生长分布较均匀密集,而阳性对照组的菌落分布零散。说明实验 成功,目的基因连接到载体形成重组质粒,转化体大肠杆菌由于携带抗Amp的基因,能在 选择性培养基Amp抗性平板生长,实现了转化体的筛选。 重组质粒的提取及酶切鉴定(Fig3Fig.4) 重组质粒DNA(含14kbc-myc基因)(B)电泳后表现为一条条带,位于约35kb处;酶切 产物(C)电泳后表现为两条条带,位置上大致与43kb和14kb相符合,前者应为质粒载 体片段,后者应为目的基因片段。图中可见两组条带的边缘均带毛刺和阴影,其他样孔 是另外两个实验组的结果,可见最左边实验组较我组结果,条带更加清晰,边缘更加平 整。造成该现象的原因将在讨论中进行分析。 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250