荧光标记的样品 共聚焦显微镜 基因芯片 获取荧光图象 杂交结果分析 在制造cDNA微阵列时,点样点的大小是不能保证完全一样的,点的排列也可能是不规 则的,这意味着要比较不同微阵列图像的荧光绝对强度是不合理的,因此通常使用双色荧光 系统来纠正点之间的差异。在制备样本时,使用两个样本,一个称为控制样本( control sample)或对照样本( reference sample),通常用绿色荧光素(Cy3)标记其cDNA 另一个为测量样本,用红色荧光素(Cy5)标记其cDNA。这两个样本按照相同的实验 方案分别制备不同荧光素标记的cDNA,并按1:1的比例混合,然后与cDNA微阵 列杂交,用不同波长的激光扫描杂交后微阵列,分别获取荧光强度,并成像。来自两个样本 的基因如果以相同水平表达则显示黄色,而如果表达水平有差异,则图像显示红色或绿色。 因此,cDNA微阵列的实验数据反映了两个样本中基因的相对表达水平。由于Cy3和C 的标记效率不相等,以及存在系统噪声等原因,通常需要对cDNA微阵列实验中获取的原 始图像数据进行归一化。例如,用Cy3、Cy5两种荧光素分别标记的一些基因的表达水 平相等,那么这些点的实验结果Cy5/C3荧光强度比率值(以下称 Ratio值)的期望值为 1,但由于得到的 Ratio值往往不等于1,这些实验偏差可以通过归一化来得到纠正。对 微阵列进行归一化的指导思想包括基于全局强度值调整、强度相关归一化、玻片之间的对比 归一化等,归一化方法包括总密度(假设两个样本中的总RNA是相等的)线性回归、 Ratio 统计、迭代log( ratIo)平均值中心化等,与微阵列扫描系统配套的软件可以完成归一化工作。 cDNA微阵列实验得到的值反映了基因的相对表达水平,即测量样本与对照样本之间荧 光信号强度的比率或者对数化的比率,这是一个无量纲的值,可用于比较一组实验中的基因 相对表达水平。如果对照样本的信号非常低,那么这个比率就可能很大,可能主要是噪声信 号,因此它很可能是无意义的。这些数据往往看作是不确定的或异常点,在后续分析时要注 意这些数据,根据需要确定是否保留以及如何纠正其值。 7.12寡核苷酸芯片 又称为基因芯片、DNA芯片。它是在玻璃片上按阵列固定寡核苷酸探针,这些探针是 在片原位合成的。现有产品中应用最广泛的是 Affymetrix公司制造的 GENECHIP芯片, 它使用一种光掩模技术和传统的DNA合成化学的组合以非常髙的密度制造寡核苷酸阵 列。例如, Affymetrix公司的 Human Genome U133芯片包含了100万个不同的寡核苷酸在制造 cDNA 微阵列时，点样点的大小是不能保证完全一样的，点的排列也可能是不规 则的，这意味着要比较不同微阵列图像的荧光绝对强度是不合理的，因此通常使用双色荧光 系统来纠正点之间的差异。在制备样本时，使用两个样本，一个称为控制样本（ control sample ）或对照样本 (reference sample) ，通常用绿色荧光素（ Cy3 ）标记其 cDNA ， 另一个为测量样本，用红色荧光素（ Cy5 ）标记其 cDNA 。这两个样本按照相同的实验 方案分别制备不同荧光素标记的 cDNA ，并按 1 ： 1 的比例混合，然后与 cDNA 微阵 列杂交，用不同波长的激光扫描杂交后微阵列，分别获取荧光强度，并成像。来自两个样本 的基因如果以相同水平表达则显示黄色，而如果表达水平有差异，则图像显示红色或绿色。 因此， cDNA 微阵列的实验数据反映了两个样本中基因的相对表达水平。由于 Cy3 和 Cy5 的标记效率不相等，以及存在系统噪声等原因，通常需要对 cDNA 微阵列实验中获取的原 始图像数据进行归一化。例如，用 Cy3 、 Cy5 两种荧光素分别标记的一些基因的表达水 平相等，那么这些点的实验结果 Cy5/Cy3 荧光强度比率值（以下称 Ratio 值）的期望值为 1 ，但由于得到的 Ratio 值往往不等于 1 ，这些实验偏差可以通过归一化来得到纠正。对 微阵列进行归一化的指导思想包括基于全局强度值调整、强度相关归一化、玻片之间的对比 归一化等，归一化方法包括总密度（假设两个样本中的总 RNA 是相等的）、线性回归、 Ratio 统计、迭代 log(ratio) 平均值中心化等，与微阵列扫描系统配套的软件可以完成归一化工作。 cDNA 微阵列实验得到的值反映了基因的相对表达水平，即测量样本与对照样本之间荧 光信号强度的比率或者对数化的比率，这是一个无量纲的值，可用于比较一组实验中的基因 相对表达水平。如果对照样本的信号非常低，那么这个比率就可能很大，可能主要是噪声信 号，因此它很可能是无意义的。这些数据往往看作是不确定的或异常点，在后续分析时要注 意这些数据，根据需要确定是否保留以及如何纠正其值。 7.1.2 寡核苷酸芯片 又称为基因芯片、 DNA 芯片。它是在玻璃片上按阵列固定寡核苷酸探针，这些探针是 在片原位合成的。现有产品中应用最广泛的是 Affymetrix 公司制造的 GENECHIP®芯片， 它使用一种光掩模技术和传统的 DNA 合成化学的组合以非常高的密度制造寡核苷酸阵 列。例如， Affymetrix 公司的 Human Genome U133 芯片包含了 100 万个不同的寡核苷酸