郭宗儒:从精准医学谈药物设计的微观结构 优化,而且对其他激酶呈现泛抑制作用,故而未作深和富含甘氨酸环套的Phe28残基,从而定位了化合物 入研究。 15的结合模式。图7是基于光亲和标记的质谱分析 遂之用高通量方法筛选了200万个化合物,得到对化合物15与RIP1的分子模拟图,可以看出分子的 的苗头化合物经优化结构,化合物10有良好的体外两端苯并嗯氮草酮和苄基分别与两个环套的Serl61 活性与选择性,然而对小鼠的口服利用度低,成药的与Phe28发生结合。 前景渺茫,也终止了研究1 5.2筛选超大型DNA编码化合物库获得了有研发 前景的苗头化合物为了发现新的结构类型,GSK筛 选了自己构建的超大型DNA编码化学库DEL),大 约有77亿个结构多样性分子(关于用DNA片段作为 条形码分别标注和识别小分子化合物的DEL,其原 理与应用可参阅文献。从中只发现极少数具有苯 富甘氨酸环套 并嗯氮草酮为母核的分子,与RP1有特异性结合 由于结构类型与已知的激酶抑制剂完全不同,分析 其结构和成药性前景,认为有必要深入研究,遂合成图7分子模拟显示的化合物15与RP1的结合图 活化环套 了相关的化合物,其中11~13有较好的抑制RIPl 酶活性和细胞活性,11的活性(IC50酶=32 nmol L 进而还用同位素方法揭示15的结合特征。首先, IC0解=16mol1)强于12和13,进而合成11的RP1经氢一氘交换将肽链上的HN交换成DN后,质 对映体14(R构型)考察活性与构型的关系,结果表谱分析显示发生显著的变化的区域有:富含甘氨酸 明14的活性完全丧失(Cs>1000mo4-),提残基的环套、活化环套、C螺旋和铰链。与化合物15 示化合物的S构型具有特异性。 低温温孵的质谱分析结果表明,前3个区域的结合作 53优化S构型的化合物结构化合物15是11用减退,而铰链处质谱行为没有发生变化,推论化合 的N甲基化合物,进一步提高了活性(C50酶=13物15未同酶的铰链区结合 molL,ICs=10 nmol- L)。同时还测定了这些54化合物15与RP1的晶体结构图8是化合物 化合物的结合动力学性质,提示化合物15的离解速15与RIP1复合物晶体结构图,显示出化合物15埋藏 率显著低于其他化合物,12蜡合=11min(km=00015在C-端和N-端结构域之间的腔穴内,没有同铰链发 s-),进一步找到15高活性和高选择性的根据 生相互作用,证实了上述氢一氘交换质谱分析的推 为了确定化合物15与RIP结合的特征,测定了论。苯并嗯氮草酮环没有占据ATP的腺嘌呤位置,而 化合物的光亲和标记作用( photoaffinity label),分别是处于a磷酸基的区域。因而15与RIP1的结合方式 合成了在15的分子结构两端(与RP结合的重要位既不是1型抑制剂,也不是纯粹作用于变构位点的2 置)引入三氟甲基二氮杂环丙烷,后者在光作用下,型抑制剂,而属于激酶的3型抑制剂 开环形成活泼的亲电性基团,对邻近氨基酸残基加6其他 以标记。经LCMS分析表明与RIP1是1:1化学计 基于靶标结构的分子设计结合药物化学的构效 量性结合,被标记的位置分别是活化环套的Serl61关系分析,在研发激酶抑制剂领域得到广泛的应用, oo ll=(S);14=(R) oo N郭宗儒: 从精准医学谈药物设计的微观结构 · 77 · 优化, 而且对其他激酶呈现泛抑制作用, 故而未作深 入研究。 遂之用高通量方法筛选了 200 万个化合物, 得到 的苗头化合物经优化结构, 化合物 10 有良好的体外 活性与选择性, 然而对小鼠的口服利用度低, 成药的 前景渺茫, 也终止了研究[14]。 5.2 筛选超大型 DNA 编码化合物库获得了有研发 前景的苗头化合物 为了发现新的结构类型, GSK筛 选了自己构建的超大型 DNA 编码化学库 (DEL), 大 约有 77 亿个结构多样性分子 (关于用 DNA 片段作为 条形码分别标注和识别小分子化合物的 DEL, 其原 理与应用可参阅文献[15])。从中只发现极少数具有苯 并噁氮䓬酮为母核的分子, 与 RIP1 有特异性结合。 由于结构类型与已知的激酶抑制剂完全不同, 分析 其结构和成药性前景, 认为有必要深入研究, 遂合成 了相关的化合物, 其中 11～13 有较好的抑制 RIP1 酶活性和细胞活性, 11 的活性 (IC50 酶 = 32 nmol·L −1 ; IC50 细胞 = 16 nmol·L −1 ) 强于 12 和 13, 进而合成 11 的 对映体 14 (R 构型), 考察活性与构型的关系, 结果表 明 14 的活性完全丧失 (IC50 酶 > 10 000 nmol·L −1 ), 提 示化合物的 S 构型具有特异性。 5.3 优化 S-构型的化合物结构 化合物 15 是 11 的 N-甲基化合物, 进一步提高了活性 (IC50 酶 = 1.3 nmol·L −1 ; IC50 细胞 =10 nmol·L −1 ) 。同时还测定了这些 化合物的结合动力学性质, 提示化合物 15 的离解速 率显著低于其他化合物, t1/2 结合 = 11 min (koff = 0.001 5 s −1 ), 进一步找到 15 高活性和高选择性的根据。 为了确定化合物 15 与 RIP1 结合的特征, 测定了 化合物的光亲和标记作用 (photoaffinity label), 分别 合成了在 15 的分子结构两端 (与 RIP1 结合的重要位 置) 引入三氟甲基二氮杂环丙烷, 后者在光作用下, 开环形成活泼的亲电性基团, 对邻近氨基酸残基加 以标记。经 LC-MS 分析表明与 RIP1 是 1∶1 化学计 量性结合, 被标记的位置分别是活化环套的 Ser161 和富含甘氨酸环套的 Phe28 残基, 从而定位了化合物 15 的结合模式。图 7 是基于光亲和标记的质谱分析 对化合物 15 与 RIP1 的分子模拟图, 可以看出分子的 两端苯并噁氮䓬酮和苄基分别与两个环套的 Ser161 与 Phe28 发生结合。 图 7 分子模拟显示的化合物 15 与 RIP1 的结合图 进而还用同位素方法揭示 15 的结合特征。首先, RIP1 经氢−氘交换将肽链上的 H-N 交换成 D-N 后, 质 谱分析显示发生显著的变化的区域有: 富含甘氨酸 残基的环套、活化环套、C 螺旋和铰链。与化合物 15 低温温孵的质谱分析结果表明, 前 3 个区域的结合作 用减退, 而铰链处质谱行为没有发生变化, 推论化合 物 15 未同酶的铰链区结合。 5.4 化合物 15 与 RIP1 的晶体结构 图 8 是化合物 15 与 RIP1 复合物晶体结构图, 显示出化合物 15 埋藏 在 C-端和 N-端结构域之间的腔穴内, 没有同铰链发 生相互作用, 证实了上述氢−氘交换质谱分析的推 论。苯并噁氮䓬酮环没有占据 ATP 的腺嘌呤位置, 而 是处于 α 磷酸基的区域。因而 15 与 RIP1 的结合方式 既不是 1 型抑制剂, 也不是纯粹作用于变构位点的 2 型抑制剂, 而属于激酶的 3 型抑制剂。 6 其他 基于靶标结构的分子设计结合药物化学的构效 关系分析, 在研发激酶抑制剂领域得到广泛的应用