药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2017,52(1):71-79 专家论坛 从精准医学谈药物设计的微观结构 郭宗儒 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所,北京100050 摘要:精准医学应用“组学”和系统生物学在分子水平上分析患者的病因,并以靶向治疗手段对患者做个 体化处治。精准医学与药物密切相关。药物作为治疗手段和物质供给侧,在精准医学中主要体现两个方面:针对 特定的靶标或机制进行新药研发;针对疾病的分子特征对患者做个体化治疗的临床应用。基于特定靶标研发新 分子实体是实施精准医疗的前提与保障;而精准医疗的效果和发现的线索又反馈于新药深化研究,二者相互依 存和促进。在精准医学的框架下,新药硏究所涵盖的大都是熟知内容:靶标的发现与确证;靶标与适应证的关联 概念验证,先导物的发现与优化;临床前研究的药效、药代和不良反应与临床试验的关联;药品设计、产业化 和药物经济学的精益化等。从分子水平的视角看,药物的疗效源于药物分子的特定原子或基团与生物大分子的 互补性和在三维空间的相互结合,这些原子基团或片段的严格排布映射了与效应靶标的精确结合。靶标蛋白即 使发生微小的残基改变,也会导致大分子的构象变化,这时药物的分子结构必须做精细的微调以适配变化了的 结构(构象)要求以避免脱靶作用。为了进行个体化治疗,需要根据患者生物标示物的分子特征选择有针对性的 药物,因而需要硏制多种新分子实体。本文列举一些实例试图解析在精准医学时代药物分子设计的某些趋势。 关键词:精准医学;药物设计;概念验证;微观结构;结合动力学 中图分类号:R916 文献标识码:A 文章编号:0513-4870(2017)01-0071-09 On the molecular drug design from viewpoint of precision medicine GUO Zong-ru (Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, ijing 100050, China) Abstract: Precision medicine(PM) involves the application of" omics"analysis and system biology to analyze the cause of disease at the molecular level for targeted treatments of individual patient. Based on the targeted treatment PM is closely related to pharmaceuticals, which, as a therapeutic means and supply front, mainly embody the two aspects: drug discovery/development, and clinical administration. Innovation of new molecular entities with safety and specific efficacy is the prerequisite and guarantee for the PM practice; on the other hand, the outcome and clues in clinical PM feedback to new drug research. PM and drug research/ application are interdependent and promote each other. Aimed at precision medicine, drug discovery and development involve well-known contents: the discovery and validation of targets, the association between target functions and indications(proof of concept), lead discovery and optimization, the association between preclinical investigations and clinical trials, the lean of industrialization and pharmacoeconomics. At the molecular level the therapeutic efficacy originates from the interactive binding between specific atoms or groups of the drug molecule and the complementary atoms or groups of the macromolecular target in three-dimensional space The strict arrangement of such critical atoms, groups, or fragments reflect specific features for a precise binding 收稿日期:2016-08-23;修回日期:2016-09-18 ◆通讯作者Te:86-10-83155752,F- mail: zrguo@ imm.accn DOl:10.16438/05134870.2016-0830
药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (1): 71 −79 · 71 · 从精准医学谈药物设计的微观结构 郭宗儒* (中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050) 摘要: 精准医学应用“组学”和系统生物学在分子水平上分析患者的病因, 并以靶向治疗手段对患者做个 体化处治。精准医学与药物密切相关。药物作为治疗手段和物质供给侧, 在精准医学中主要体现两个方面: 针对 特定的靶标或机制进行新药研发; 针对疾病的分子特征对患者做个体化治疗的临床应用。基于特定靶标研发新 分子实体是实施精准医疗的前提与保障; 而精准医疗的效果和发现的线索又反馈于新药深化研究, 二者相互依 存和促进。在精准医学的框架下, 新药研究所涵盖的大都是熟知内容: 靶标的发现与确证; 靶标与适应证的关联 (概念验证); 先导物的发现与优化; 临床前研究的药效、药代和不良反应与临床试验的关联; 药品设计、产业化 和药物经济学的精益化等。从分子水平的视角看, 药物的疗效源于药物分子的特定原子或基团与生物大分子的 互补性和在三维空间的相互结合, 这些原子基团或片段的严格排布映射了与效应靶标的精确结合。靶标蛋白即 使发生微小的残基改变, 也会导致大分子的构象变化, 这时药物的分子结构必须做精细的微调以适配变化了的 结构 (构象) 要求以避免脱靶作用。为了进行个体化治疗, 需要根据患者生物标示物的分子特征选择有针对性的 药物, 因而需要研制多种新分子实体。本文列举一些实例试图解析在精准医学时代药物分子设计的某些趋势。 关键词: 精准医学; 药物设计; 概念验证; 微观结构; 结合动力学 中图分类号: R916 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2017) 01-0071-09 On the molecular drug design from viewpoint of precision medicine GUO Zong-ru* (Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China) Abstract: Precision medicine (PM) involves the application of “omics” analysis and system biology to analyze the cause of disease at the molecular level for targeted treatments of individual patient. Based on the targeted treatment PM is closely related to pharmaceuticals, which, as a therapeutic means and supply front, mainly embody the two aspects: drug discovery/development, and clinical administration. Innovation of new molecular entities with safety and specific efficacy is the prerequisite and guarantee for the PM practice; on the other hand, the outcome and clues in clinical PM feedback to new drug research. PM and drug research/ application are interdependent and promote each other. Aimed at precision medicine, drug discovery and development involve well-known contents: the discovery and validation of targets, the association between target functions and indications (proof of concept), lead discovery and optimization, the association between preclinical investigations and clinical trials, the lean of industrialization and pharmacoeconomics. At the molecular level the therapeutic efficacy originates from the interactive binding between specific atoms or groups of the drug molecule and the complementary atoms or groups of the macromolecular target in three-dimensional space. The strict arrangement of such critical atoms, groups, or fragments reflect specific features for a precise binding 收稿日期: 2016-08-23; 修回日期: 2016-09-18. *通讯作者 Tel: 86-10-83155752, E-mail: zrguo@imm.ac.cn DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-0830 ·专家论坛·
药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2017,52(1):71-79 to the corresponding target. An alteration of amino acid residues in mutational targets leads to the change in conformation of the target protein, and an accurate structure of drug is necessary for binding to the mutant species and avoiding off-targeting effect. For the tailoring of clinical treatment to the individual patient design and development of various new molecular entities are critical for treatment choice according to the molecular features of biological markers of patients. This article provides some examples and methods of drug design and Key words: precision medicine; drug design; proof of concept; microscopic structure; binding kinetics 1引言 染色体基因变异,“量体裁衣”研制出的。细胞和分 医药科技的发展不断提出新的治疗策略和概念,子生物学研究发现染色体22号与9号的相互易位 近年来出现的精准医学( precision medicine)的概念,导致22号染色体变短,称作费城短染色体,它携带 其核心是通过基因组和蛋白质组学等技术,对于大有Bcr-Abl癌基因,表达的Bcr-Abl融合蛋白,含有功 样本人群与特定疾病类型从分子水平进行分析与鉴能高度激活的酪氨酸激酶,导致细胞内信号转导的 定、验证与应用,从而精确寻找到疾病的原因和治疗失控,引起慢性粒细胞白血病(CML)的发生。CML 的靶标,最终实现对于疾病和特定患者进行个体化具有Abl激酶高表达的遗传特征,作为分子靶标,诺 的精细和准确的治疗。 华成功研制口服治疗CML的药物伊马替尼(1 精准医学与药物密切相关,药物是疾病治疗的 imatinib),经概念验证和临床研究,成为首个治疗 手段和物质保障,在精准医学的框架下体现在两个CML的有效药物,也因此开创了分子靶向药物治疗 方面:一是针对特定的靶标或机制进行新药研发,提的新领域 供安全有效特异和经济的药物;二是临床应用,根据 伊马替尼是通过基于结构的药物设计(SBDD) 患者疾病类型和病情进行个体化的准确治疗。创制安与药物化学构效关系(SAR)而实现结构优化的,研 全有效乃至特效的药物是实现精确治疗的前提与保制过程漫长而曲折,本文不拟作全面介绍,只从晶体 障;按精准原则治疗的结果以及发现的线索或问题结构和结合特征对设计的关键问题加以说明。图la 又反馈于深化新药研究,二者相互依存和促进。 和b分别是伊马替尼与Abl激酶的结合特征和疏水结 笔者不拟使用“精准药学”一语,盖因见仁见合的内环境。其结合要点概述如下:①苯环A的6 智。就新药研发而言,在精准的目标下所涵盖的大都位甲基(又称作旗甲基,fag- methyl)设计的重要性: 是熟知的内容:靶标的发现与确证;靶标与适应证的甲基处于NH-的邻位,邻位基团的阻转效应逼迫嘧 关联(概念验证),先导物的发现与优化,临床前研究啶连同吡啶环发生一定角度的扭转,定向地采取了 的药效、药代和不良反应与临床试验的关联;药品设稳定的构象,将吡啶环“送到”酶的Tyr253残基处, 计、产业化和药物经济学的精益化等等,通过全价值发生ππ结合作用;②连接苯环A与嘧啶环的-NH- 链的实施与监管,提供给精准治疗以安全有效药物。作为氢键给体与酶的重要残基Thr315的侧链羟基 本文拟从药物分子设计的一角,特别是从成功药物与(接受体)形成氢键,Th315是催化中心的门户氨基 靶标结合的微观特征,讨论研发中的一些细节问题。酸,守护和维持催化过程。由于羟基与伊马替尼的 2基于基因差异—伊马替尼的研制 -NH-形成氢键,Thr315失去了门户守卫的作用;③A 治疗慢性粒细胞白血病药物的伊马替尼是基于环4位的连接基-NHCO-将B环及其连接的片段引 Leu354 CH3 I 图1伊马替尼分子(黑色)与Abl激酶的结合特征(a)、与Abl疏水结合示意图(b)
· 72 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (1): 71 −79 to the corresponding target. An alteration of amino acid residues in mutational targets leads to the change in conformation of the target protein, and an accurate structure of drug is necessary for binding to the mutant species and avoiding off-targeting effect. For the tailoring of clinical treatment to the individual patient design and development of various new molecular entities are critical for treatment choice according to the molecular features of biological markers of patients. This article provides some examples and methods of drug design and development in the new period. Key words: precision medicine; drug design; proof of concept; microscopic structure; binding kinetics 1 引言 医药科技的发展不断提出新的治疗策略和概念, 近年来出现的精准医学 (precision medicine) 的概念, 其核心是通过基因组和蛋白质组学等技术, 对于大 样本人群与特定疾病类型从分子水平进行分析与鉴 定、验证与应用, 从而精确寻找到疾病的原因和治疗 的靶标, 最终实现对于疾病和特定患者进行个体化 的精细和准确的治疗。 精准医学与药物密切相关, 药物是疾病治疗的 手段和物质保障, 在精准医学的框架下体现在两个 方面: 一是针对特定的靶标或机制进行新药研发, 提 供安全有效特异和经济的药物; 二是临床应用, 根据 患者疾病类型和病情进行个体化的准确治疗。创制安 全有效乃至特效的药物是实现精确治疗的前提与保 障; 按精准原则治疗的结果以及发现的线索或问题 又反馈于深化新药研究, 二者相互依存和促进。 笔者不拟使用“精准药学”一语, 盖因见仁见 智。就新药研发而言, 在精准的目标下所涵盖的大都 是熟知的内容: 靶标的发现与确证; 靶标与适应证的 关联 (概念验证); 先导物的发现与优化; 临床前研究 的药效、药代和不良反应与临床试验的关联; 药品设 计、产业化和药物经济学的精益化等等, 通过全价值 链的实施与监管, 提供给精准治疗以安全有效药物。 本文拟从药物分子设计的一角, 特别是从成功药物与 靶标结合的微观特征, 讨论研发中的一些细节问题。 2 基于基因差异——伊马替尼的研制 治疗慢性粒细胞白血病药物的伊马替尼是基于 染色体基因变异, “量体裁衣”研制出的。细胞和分 子生物学研究发现染色体 22 号与 9 号的相互易位, 导致 22 号染色体变短, 称作费城短染色体, 它携带 有 Bcr-Abl 癌基因, 表达的 Bcr-Abl 融合蛋白, 含有功 能高度激活的酪氨酸激酶, 导致细胞内信号转导的 失控, 引起慢性粒细胞白血病 (CML) 的发生。CML 具有 Abl 激酶高表达的遗传特征, 作为分子靶标, 诺 华成功研制口服治疗 CML 的药物伊马替尼 (1, imatinib), 经概念验证和临床研究, 成为首个治疗 CML 的有效药物, 也因此开创了分子靶向药物治疗 的新领域。 伊马替尼是通过基于结构的药物设计 (SBDD) 与药物化学构效关系 (SAR) 而实现结构优化的, 研 制过程漫长而曲折, 本文不拟作全面介绍, 只从晶体 结构和结合特征对设计的关键问题加以说明。图 1a 和 b 分别是伊马替尼与 Abl 激酶的结合特征和疏水结 合的内环境。其结合要点概述如下: ① 苯环 A 的 6 位甲基 (又称作旗甲基, flag-methyl) 设计的重要性: 甲基处于 -NH- 的邻位, 邻位基团的阻转效应逼迫嘧 啶连同吡啶环发生一定角度的扭转, 定向地采取了 稳定的构象, 将吡啶环“送到”酶的 Tyr253 残基处, 发生 π-π 结合作用; ② 连接苯环 A 与嘧啶环的-NH- 作为氢键给体与酶的重要残基 Thr315 的侧链羟基 (接受体) 形成氢键, Thr315 是催化中心的门户氨基 酸, 守护和维持催化过程。由于羟基与伊马替尼的 -NH-形成氢键, Thr315 失去了门户守卫的作用; ③ A 环 4 位的连接基-NH-CO-将 B 环及其连接的片段引 图 1 伊马替尼分子 (黑色) 与 Abl 激酶的结合特征 (a)、与 Abl 疏水结合示意图 (b)
郭宗儒:从精准医学谈药物设计的微观结构 导并插入到酶的裂隙之中,苯环B进入由le293、 Leu298和Leu354构成的疏水腔内,将本来“埋入” 其中的活性环套( A-loop)的DFG挤出,使DFG-in 变成DFG-out构象,而ATP对酪氨酸的磷酸化须为 DFG-in构象。这样,伊马替尼通过影响变构位点阻断 了激酶的催化功能 这些关键性的微观特征保障了伊马替尼分子的 分子形状(构象)从而发生特异性结合山。 CONH-的反向调整 3克服对伊马替尼耐药的帕那替尼 8 2001年上市的伊马替尼作为治疗慢性粒细胞白 血病的有效药物,长期应用产生耐药性。分子生物学 研究发现,癌细胞为了逃逸伊马替尼的作用,将门户图2帕那替尼与AB晶体结构简图 氨基酸残基( gatekeeper)发生突变,The3l5变异为 Il615,这样,在结构上氨基酸侧链由CH(CH3)OH变 用( enthalpy- entropy compensaton,即焓强熵弱或熵 成CH(CH3CH2CH3,不仅体积变大,空间上阻碍了 强焓弱),但精细的分子设计可以实现焓一熵同向正贡 献,并且使焓贡献最大化,降低仍属正贡献的熵份额, 伊马替尼的进入,而且侧链的羟基缺失,失去与伊马 成为优质药物。疏水性药物与靶标的结合往往是熵因 替尼形成氢键的能力,导致疗效减退。从变异后的结 构特征如何克服耐药性呢? 素占优,结合能大都来源于疏水结合,这种结合的特 ARIAD公司为克服Ab1l变异导致的耐药性, 异性不如焓因素(例如氢键,盐键等)高,而且高疏 水性药物的代谢作用也比较复杂 研发的帕那替尼(2, ponatinib)于2011年上市,帕那 Tibotec公司研制的地瑞那韦(3, darunavit)经 替尼对耐药的激酶和细胞有强效抑制活性(Co分别美国FDA批准于2006年上市,治疗艾滋病。地瑞那 为40和88 nmol.L)。研发者针对Abl11结构变异, 韦是模拟水解反应过渡态的HVⅤ蛋白酶抑制剂,属 关键的设计有两点:①变换了伊马替尼苯环A与嘧 于第二代产品。从化学结构看,地瑞那韦类似于GSK 啶环相连的-NH-基,既然Ab13的门户残基无氢键 公司研制的安普那韦(4, amprenavir),只是在四氢呋 形成能力,而且扩大了空间障碍,就没有必要保留 喃环上又并合了一个四氢呋喃环 NH-片段,而是用乙炔基连接苯环A与杂环。乙炔 基是疏水性的线型小体积连接基,它避开异亮氨酸 侧链的阻挡,使得咪唑并吡啶杂环得以进入疏水腔 中。此处乙炔基为”光秃”的两个p杂化的碳原子 位阻最小,长度适宜。相应的乙烯基或亚乙基化合物 活性降低,提示反式或顺式双键以及柔性的亚乙基 不利于结合,说明精确设计乙炔基之成功。②将A 环的4-胺酰基变为3-酰胺基,位置的变迁和胺酰基 的逆向,增强了氢键的结合力,并且有利于将苯环B 输送入疏水腔中。图2是帕那替尼与Abl13l晶体结 构的简图,标示出乙炔基与异亮氨酸侧链的相对位 置以及酰胺片段的结合特征2。 地瑞那韦与上市前的“那韦”类药物的结构虽 4发掘和利用药物与靶标有利结合的微观特征 然不同,但与HV蛋白酶活性部位的结合模式大同 41提高结合热力学的焓贡献—一第二代HIV蛋白小异,都是蛋白酶底物的过渡态类似物,呈现抑制活 酶抑制剂地瑞那韦药物的活性取决于同靶标的结性的结合力包括疏水作用和氢键结合,以疏水作用 合强度,结合能ΔG越高,活性越强。热力学告诉我为主,因而是熵驱动占优的结合。而地瑞那韦则是以 们,药物与靶标结合的自由能是由焓(△H)与熵焓为主要贡献。表1列出了有代表性的沙奎那韦、替 (-TΔS)构成,虽然焓与熵之间的贡献往往有补偿作拉那韦、安普那韦和地瑞那韦的活性和热力学特征
郭宗儒: 从精准医学谈药物设计的微观结构 · 73 · 导并插入到酶的裂隙之中, 苯环 B 进入由 Ile293、 Leu298 和 Leu354 构成的疏水腔内, 将本来“埋入” 其中的活性环套 (A-loop) 的 DFG 挤出, 使 DFG-in 变成 DFG-out 构象, 而 ATP 对酪氨酸的磷酸化须为 DFG-in 构象。这样, 伊马替尼通过影响变构位点阻断 了激酶的催化功能。 这些关键性的微观特征保障了伊马替尼分子的 分子形状 (构象) 从而发生特异性结合[1]。 3 克服对伊马替尼耐药的帕那替尼 2001 年上市的伊马替尼作为治疗慢性粒细胞白 血病的有效药物, 长期应用产生耐药性。分子生物学 研究发现, 癌细胞为了逃逸伊马替尼的作用, 将门户 氨基酸残基 (gatekeeper) 发生突变, The315 变异为 Ile315, 这样, 在结构上氨基酸侧链由 CH(CH3)OH 变 成 CH(CH3)CH2CH3, 不仅体积变大, 空间上阻碍了 伊马替尼的进入, 而且侧链的羟基缺失, 失去与伊马 替尼形成氢键的能力, 导致疗效减退。从变异后的结 构特征如何克服耐药性呢？ ARIAD 公司为克服 AblT315I 变异导致的耐药性, 研发的帕那替尼 (2, ponatinib) 于 2011 年上市, 帕那 替尼对耐药的激酶和细胞有强效抑制活性 (IC50 分别 为 40 和 8.8 nmol·L −1 )。研发者针对 AblT315I 结构变异, 关键的设计有两点: ① 变换了伊马替尼苯环 A 与嘧 啶环相连的-NH-基, 既然 AblT315I 的门户残基无氢键 形成能力, 而且扩大了空间障碍, 就没有必要保留 -NH-片段, 而是用乙炔基连接苯环 A 与杂环。乙炔 基是疏水性的线型小体积连接基, 它避开异亮氨酸 侧链的阻挡, 使得咪唑并吡啶杂环得以进入疏水腔 中。此处乙炔基为”光秃”的两个 sp 1 杂化的碳原子, 位阻最小, 长度适宜。相应的乙烯基或亚乙基化合物 活性降低, 提示反式或顺式双键以及柔性的亚乙基 不利于结合, 说明精确设计乙炔基之成功。② 将 A 环的 4-胺酰基变为 3-酰胺基, 位置的变迁和胺酰基 的逆向, 增强了氢键的结合力, 并且有利于将苯环 B 输送入疏水腔中。图 2 是帕那替尼与 AblT315I 晶体结 构的简图, 标示出乙炔基与异亮氨酸侧链的相对位 置以及酰胺片段的结合特征[2]。 4 发掘和利用药物与靶标有利结合的微观特征 4.1 提高结合热力学的焓贡献——第二代 HIV 蛋白 酶抑制剂地瑞那韦 药物的活性取决于同靶标的结 合强度, 结合能 ΔG 越高, 活性越强。热力学告诉我 们, 药物与靶标结合的自由能是由焓 (ΔH) 与熵 (−TΔS) 构成, 虽然焓与熵之间的贡献往往有补偿作 图 2 帕那替尼与 AblT315I晶体结构简图 用 (enthalpy-entropy compensaton, 即焓强熵弱或熵 强焓弱), 但精细的分子设计可以实现焓−熵同向正贡 献, 并且使焓贡献最大化, 降低仍属正贡献的熵份额, 成为优质药物。疏水性药物与靶标的结合往往是熵因 素占优, 结合能大都来源于疏水结合, 这种结合的特 异性不如焓因素 (例如氢键, 盐键等) 高, 而且高疏 水性药物的代谢作用也比较复杂。 Tibotec 公司研制的地瑞那韦 (3, darunavir) 经 美国 FDA 批准于 2006 年上市, 治疗艾滋病。地瑞那 韦是模拟水解反应过渡态的 HIV 蛋白酶抑制剂, 属 于第二代产品。从化学结构看, 地瑞那韦类似于 GSK 公司研制的安普那韦 (4, amprenavir), 只是在四氢呋 喃环上又并合了一个四氢呋喃环。 地瑞那韦与上市前的“那韦”类药物的结构虽 然不同, 但与 HIV 蛋白酶活性部位的结合模式大同 小异, 都是蛋白酶底物的过渡态类似物, 呈现抑制活 性的结合力包括疏水作用和氢键结合, 以疏水作用 为主, 因而是熵驱动占优的结合。而地瑞那韦则是以 焓为主要贡献。表 1 列出了有代表性的沙奎那韦、替 拉那韦、安普那韦和地瑞那韦的活性和热力学特征
74· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2017,52(1):71-79 表1地瑞那韦与其他那韦药物的热力学特征 合物取舍的标准,然而,离解常数或IC5o是在封闭的 药物 T△S 平衡状态下测定的热力学特征,是在受试化合物浓 amolL-I /kJ.moll /k -mol-l /.mol-I 沙奎那韦20 度不变的状态下测定的。其实,从深层次上挖掘,还 茚地那韦 0.049 有药物与靶标的结合动力学行为 安普那韦 0.39 55.2 28.8 机体是个开放系统,药物在体内是个动态过程 也瑞那韦0.00 627 53.1 在血浆和细胞中的药物水平处于不断地变化中。在体 内药物与靶标形成复合物,其离解作用不受游离药 表1的数据表明,地瑞那韦的的活性强于既往的 物浓度的影响,复合物的离解速率kr决定了药物占 药物十倍至数百倍。比安普那韦强85倍。更重要的据靶标和与之结合的时程,结合的半衰期(12合,与 是地瑞那韦结合能的焓贡献是熵的5倍,而其他那韦药代的h2不同)越长,在靶标处驻留时间( (residence 多数是熵大于焓,即使安普那韦也只是焓熵持平。地 time,RT)越久,作用时程越长,因而有效剂量低,选 瑞那韦的用药剂量低,有效剂量低是高选择性和低择性高、脱靶性低。用放射性标记测定酶抑制剂的结 脱靶性的表现。此外,地瑞那韦对多种耐药株也有抑 合(ka)与离解速率常数(ktr),非标记方法如用电生 制活性。分析地瑞那韦结构和结合特征,表明与活性 理方法(如膜片钳技术)或表面等离子共振( surface 中心发生了广泛的氢键结合。图3是地瑞那韦与 plasmon resonance,SPR)和核磁共振技术。测定受试 HV蛋白酶复合物晶体结构的简约图,图中的9条虚 物的k与kor值(并由此计算出离解常数Ka值),依 线表示形成的氢键网络结构,将药物分子牢固地结此可分析化学结构与结合动力学关系(SKR)。SKR 合于催化中心。特别是并合的四氢呋喃环,氧原子与 Asp29和Asp30又形成两个氢键,增加的结合能来源 是深层次的SAR,在一定意义上更接近体内的状态 于焓贡献,大大提高了抑酶活性。所以,地瑞那韦是当然,用细胞测定受试物动态物质重分布( dynamic 在结构生物学和分子模拟的指引下,利用了活性中 mass redistribution)或整体动物用正电子发射断层显 心“空余”的氢键给体,在安普那韦的基础上设计 影技术向(PET),所测定的药物结合动力学数据更加 实用。 出有质性飞跃的蛋白酶抑制剂向。 药物分子与靶标的结合速率ko大,离解速率k 小,是由于结合过程伴随构象的变化,尤其是靶标蛋 白构象的改变,提高了离解过程的能垒,复原成游离 状态须越过较高的能垒,以至于km变小,造成“来 之容易去之难”的后果。由于蛋白质的柔性和构象复 杂性,还不能从微观结构预测结合动力学性质,但药 物化学的SKR分析和复合物晶体结构特征,可有助 于理解动力学的某些过程。例如研究周期蛋白依赖性 激酶8周期蛋白C抑制剂,化合物5的侧链增加 图3地瑞那韦与HV蛋白酶复合物的结合模式。虚线代表氢个亚甲基为化合物6,进而变换为叔丁氧羰化合物7, 键结合,圆点为参与复合物生成的结构水 动力学性质乃至热力学的参数都发生显著改变,表2 列出了这些数据 4.2利用结合动力学特征研制高选择性、低脱靶性 表2的数据表明,化合物5~7的骨架结构相同 和长效型药物初始的先导物优化,往往以对靶标影响热力学和动力学变化的主要因素是脲基连接的 的离解常数或ICs0作为活性判断、研究构效关系和化侧链不同。化合物5活性弱,K3500 moll-,h结合 H3CX H2C Y
· 74 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (1): 71 −79 表 1 地瑞那韦与其他那韦药物的热力学特征 药物 Ki /nmol·L −1 ΔG /kJ·mol−1 ΔH /kJ·mol−1 −TΔS /kJ·mol−1 沙奎那韦 2.0 −53.5 −13.0 −66.5 茚地那韦 0.049 −51.8 −7.6 −59.4 安普那韦 0.39 −55.2 −28.8 −26.4 地瑞那韦 0.0045 −62.7 −53.1 −9.6 表 1 的数据表明, 地瑞那韦的的活性强于既往的 药物十倍至数百倍。比安普那韦强 85 倍。更重要的 是地瑞那韦结合能的焓贡献是熵的 5 倍, 而其他那韦 多数是熵大于焓, 即使安普那韦也只是焓熵持平。地 瑞那韦的用药剂量低, 有效剂量低是高选择性和低 脱靶性的表现。此外, 地瑞那韦对多种耐药株也有抑 制活性。分析地瑞那韦结构和结合特征, 表明与活性 中心发生了广泛的氢键结合[3]。图 3 是地瑞那韦与 HIV 蛋白酶复合物晶体结构的简约图, 图中的 9 条虚 线表示形成的氢键网络结构, 将药物分子牢固地结 合于催化中心。特别是并合的四氢呋喃环, 氧原子与 Asp29'和 Asp30'又形成两个氢键, 增加的结合能来源 于焓贡献, 大大提高了抑酶活性。所以, 地瑞那韦是 在结构生物学和分子模拟的指引下, 利用了活性中 心“空余”的氢键给体, 在安普那韦的基础上设计 出有质性飞跃的蛋白酶抑制剂[4]。 图 3 地瑞那韦与 HIV 蛋白酶复合物的结合模式。虚线代表氢 键结合, 圆点为参与复合物生成的结构水 4.2 利用结合动力学特征研制高选择性、低脱靶性 和长效型药物 初始的先导物优化, 往往以对靶标 的离解常数或 IC50 作为活性判断、研究构效关系和化 合物取舍的标准, 然而, 离解常数或 IC50 是在封闭的 平衡状态下测定的热力学特征, 是在受试化合物浓 度不变的状态下测定的。其实, 从深层次上挖掘, 还 有药物与靶标的结合动力学行为。 机体是个开放系统, 药物在体内是个动态过程, 在血浆和细胞中的药物水平处于不断地变化中。在体 内药物与靶标形成复合物, 其离解作用不受游离药 物浓度的影响, 复合物的离解速率 koff 决定了药物占 据靶标和与之结合的时程, 结合的半衰期 (t1/2 结合, 与 药代的 t1/2不同) 越长, 在靶标处驻留时间 (residence time, RT) 越久, 作用时程越长, 因而有效剂量低, 选 择性高, 脱靶性低。用放射性标记测定酶抑制剂的结 合 (kon) 与离解速率常数 (koff), 非标记方法如用电生 理方法 (如膜片钳技术) 或表面等离子共振 (surface plasmon resonance, SPR) 和核磁共振技术。测定受试 物的 kon 与 koff 值 (并由此计算出离解常数 Kd 值), 依 此可分析化学结构与结合动力学关系 (SKR)。SKR 是深层次的 SAR, 在一定意义上更接近体内的状态。 当然, 用细胞测定受试物动态物质重分布[5] (dynamic mass redistribution) 或整体动物用正电子发射断层显 影技术[6] (PET), 所测定的药物结合动力学数据更加 实用。 药物分子与靶标的结合速率 kon 大, 离解速率 koff 小, 是由于结合过程伴随构象的变化, 尤其是靶标蛋 白构象的改变, 提高了离解过程的能垒, 复原成游离 状态须越过较高的能垒, 以至于 koff 变小, 造成“来 之容易去之难”的后果。由于蛋白质的柔性和构象复 杂性, 还不能从微观结构预测结合动力学性质, 但药 物化学的 SKR 分析和复合物晶体结构特征, 可有助 于理解动力学的某些过程。例如研究周期蛋白依赖性 激酶 8/周期蛋白 C 抑制剂, 化合物 5 的侧链增加两 个亚甲基为化合物 6, 进而变换为叔丁氧羰化合物 7, 动力学性质乃至热力学的参数都发生显著改变, 表 2 列出了这些数据。 表 2 的数据表明, 化合物 5～7 的骨架结构相同, 影响热力学和动力学变化的主要因素是脲基连接的 侧链不同。化合物 5 活性弱, Kd 3 500 nmol·L −1 , t1/2 结合
郭宗儒:从精准医学谈药物设计的微观结构 表2化合物5~7与周期蛋白依赖性激酶8/周期蛋白C的结 H3C.+cH3·Br 合动力学与热力学特征 化合物 Ka/nmol.L-km/s-( mol L-)kor/ s 112 4/min 3500 太快测不出1.0×1 YOH 80 3.7×103 2.9×10 5.7×102 86×10-61400 表3噻托溴铵对毒蕈碱M3和M2受体的离解常数和结合动 只有1.2min,晶体结构表明末端羟基作为氢键给体 力学性质 与活化环套DMG的Met14的羰基形成氢键(图 受体Kd/hmol1-k/s-1·(molL-b)1ks/s 4a)。化合物6的侧链增加了两个亚甲基,结合活性提 3.1×107 3.2×10-4374 高了40多倍,离解速率变慢,t1n结合=40min,晶体学 16×103 基形成氢键(图4b)。化合物7的侧链进一步增长,并M3和M受体的活性参数 以叔丁基为终端,结合作用增强7倍,离解速率很小, 如果只从Kd值分析,由于对M3和M2受体活性 1n2合=1400min,虽然没有形成氢键的羟基,但化合相近,预示着脱靶作用会引起心脏的不良反应。然而 物7在活性中心占据的空间和形状加大(图4c灰色结合动力学的km值相差很大,对M3受体有很长的 部分),活化环套的构象发生显著变化,离解复原成1mDR比M2长10倍,在动力学的层面上体现出选 游离态需要越过较高的能垒,因而7不仅活性强,而择性作用。噻托溴铵作为日服一次的长效喷雾剂,未 且在活性部位的驻留时间也长,预示7的作用时间持显示对心脏的副作用。此外,由于tDR长,即使血 久,选择性高。 药浓度的谷值降到 pmol- mL,仍然维持有舒张气管 另一个实例是治疗慢性阻塞性肺病药物噻托溴作用。分子动力学模拟显示,当噻托溴铵从M3受体 铵(8, tiotropium bromide),于2012年在美国上市。的结合部位解离出去时,要经历如图5a箭头所示的 噻托溴铵是毒蕈碱M3受体阻断剂,可扩张支气管治路径,图中的黑点代表了噻托溴铵的莨菪烷上的C3 疗哮喘和慢阻肺。其实,噻托溴铵对M2受体也有抑原子的踪迹,最终停留在胞外受体的门庭处(虚线圈 制作用,但并未显示出对心脏的不良反应,原因是结附近)若将噻托溴铵放到溶剂中(图5b,分子所处 合动力学提高了选择性作用。表3列出了噻托溴铵对的位置大致与图5a的门庭处相同。用M2受体作动 图4化合物5~7与周期蛋白依赖性激酶8的晶体结构图 过渡态 游离态 时间 时间/ps 噻托溴铵与M3和M2受体结合-离解铡吃过程 图5噻托溴铵与M3受体动力学模拟(a和b)和复合物离解过程的自由能变化图(c)
郭宗儒: 从精准医学谈药物设计的微观结构 · 75 · 表 2 化合物 5～7 与周期蛋白依赖性激酶 8/周期蛋白 C 的结 合动力学与热力学特征 化合物 Kd /nmol·L −1 kon /s−1 ·(mol·L −1 ) −1 koff /s−1 t1/2 结合/min 5 3 500 太快测不出 1.0×10−2 1.2 6 80 3.7×103 2.9×10−4 40 7 10 5.7×102 8.6×10−6 1 400 只有 1.2 min, 晶体结构表明末端羟基作为氢键给体 与活化环套 DMG 的 Met174 的羰基形成氢键 (图 4a)。化合物 6 的侧链增加了两个亚甲基, 结合活性提 高了 40 多倍, 离解速率变慢, t1/2 结合 =40 min, 晶体学 提示侧链呈伸展型构象, 6 的末端 OH 与 Asp98 的羰 基形成氢键 (图 4b)。化合物 7 的侧链进一步增长, 并 以叔丁基为终端, 结合作用增强 7 倍, 离解速率很小, t1/2 结合 =1 400 min, 虽然没有形成氢键的羟基, 但化合 物 7 在活性中心占据的空间和形状加大 (图 4c 灰色 部分), 活化环套的构象发生显著变化, 离解复原成 游离态需要越过较高的能垒, 因而 7 不仅活性强, 而 且在活性部位的驻留时间也长, 预示 7 的作用时间持 久, 选择性高[7]。 另一个实例是治疗慢性阻塞性肺病药物噻托溴 铵 (8, tiotropium bromide), 于 2012 年在美国上市。 噻托溴铵是毒蕈碱 M3 受体阻断剂, 可扩张支气管治 疗哮喘和慢阻肺。其实, 噻托溴铵对 M2 受体也有抑 制作用, 但并未显示出对心脏的不良反应, 原因是结 合动力学提高了选择性作用。表 3 列出了噻托溴铵对 表 3 噻托溴铵对毒蕈碱 M3 和 M2 受体的离解常数和结合动 力学性质 受体 Kd /nmol·L −1 kon /s−1 ·(mol·L −1 ) −1 koff /s−1 t1/2 结合/h M3 0.01 3.1×107 3.2×10−4 37.4 M2 0.02 1.6×108 3.1×10−3 3.5 M3 和 M2 受体的活性参数[8]。 如果只从 Kd 值分析, 由于对 M3 和 M2 受体活性 相近, 预示着脱靶作用会引起心脏的不良反应。然而 结合动力学的 koff 值相差很大, 对 M3 受体有很长的 t1/2(DR), 比 M2 长 10 倍, 在动力学的层面上体现出选 择性作用。噻托溴铵作为日服一次的长效喷雾剂, 未 显示对心脏的副作用。此外, 由于 t1/2(DR)长, 即使血 药浓度的谷值降到 pmol·mL−1 , 仍然维持有舒张气管 作用。分子动力学模拟显示, 当噻托溴铵从 M3 受体 的结合部位解离出去时, 要经历如图 5a 箭头所示的 路径, 图中的黑点代表了噻托溴铵的莨菪烷上的 C3 原子的踪迹, 最终停留在胞外受体的门庭处 (虚线圈 附近); 若将噻托溴铵放到溶剂中 (图 5b), 分子所处 的位置大致与图 5a 的门庭处相同。用 M2 受体作动 图 4 化合物 5～7 与周期蛋白依赖性激酶 8 的晶体结构图 图 5 噻托溴铵与 M3 受体动力学模拟 (a 和 b) 和复合物离解过程的自由能变化图 (c)
药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2017,52(1):71-79 力学分子模拟,由于跨膜蛋白的柔性和可移动性强多个去水合位点,其中Bcr-Abl的Met318与Gly321 于M3受体,噻托溴铵在受体部位的驻留时间短,较之间形成了完全被疏水包裹的氢键,而在c-Kit激酶 快地离开M2受体,体现了动力学选择过程。图5c结构域中的Cys673与Gly676生成的氢键是有缺陷 是噻托溴铵与M3和M2结合与离解过程的自由能变的去水合位点,因而,如果在伊马替尼接近Cys673- 化图,与M3的复合物过渡态自由能高于M2,显示出Gly676的部位加入疏水性基团,有可能提高和改变 慢离解特征阿。 对cKit激酶的结合。图6是化合物9(WBZ_4,在伊 43利用去水合位点的分子再设计去水合位点马替尼的吡啶环上连接4-甲基)与Bcr-Abl和cKit ( dehydrons)是蛋白质结构域中比较常见的现象,它激酶分子对接图,甲基的引入干预了cKt去水合位 的发生是当可溶性蛋白在空间排布构成高级结构时,点,提高了肿瘤细胞c-Kit激酶氢键的稳定性和结合 在不相邻的氨基酸残基之间可形成氢键NH…O=C,强度,而对于心脏c-Kit的去水和位点影响小,因而 如果由于所处的环境使该氢键一部分被水合、一部分提高了抑制肿瘤的选择性作用山,12。 被疏水性基团包围,这样的氢键就不太稳定,被认为5受体相互作用蛋白1激酶抑制剂的研究 是有缺陷的氢键,这种氢键具有亲近疏水基团、“挤 本节所叙述的例子还未达到成药上市的阶段 走”水分子的趋势,因为氢键在疏水环境中更加稳但从发现苗头和先导物、优化的理念和机制的论证 定。去水合位点具有趋近、吸引和融合非极性基团的所用的技术方法对于精准的药物研发有所借鉴。 倾向,易于接近配体的非极性基团,因而利用存在的5.1常规性普筛未能获得苗头化合物受体相互作 去水合位点在原有配体(或药物)的基础上可设计用蛋白1激酶( (receptor interacting protein1 kinase, 新的配体分子( redesign),从而提高选择性,降低脱RP1)是肿瘤坏死因子介导的炎症和病理过程的重 靶作用0。 要驱动剂,例如,调控前炎性细胞因子的产生,引起 利用水合位点进行重新设计的一个实例,是对细胞凋亡,以及下调TNF受体1的表达等,因而是最 抗肿瘤药物伊马替尼(1)结构的再优化。前已述及,近发现的治疗多种炎症的药物靶标 伊马替尼是抑制Bcr-Abl和c-Kit激酶的抗肿瘤药物, 为了发现先导物,GSK公司首先用既往研发激酶 但由于脱靶作用而抑制心脏c-Kit激酶,导致心肌细抑制剂所合成的化合物,特别关注筛选结合于活性 胞的ATP枯竭,引起心脏损伤。对伊马替尼分子的再环套的DFG-out构象的2型抑制剂,进行了广泛的筛 设计,是利用 Bcr-Abl和c-Kit激酶的结合部位存在选,虽发现了活性化合物,但由于分子尺寸大,难以 Catalytic aC-Helix Imatinib 甲基与去水合 位点的作用 Bcr-Abi M318-G32I well-wrapped HB 图64甲基伊马替尼与cKt去水合位点(绿色)的疏水相互作用
· 76 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (1): 71 −79 力学分子模拟, 由于跨膜蛋白的柔性和可移动性强 于 M3 受体, 噻托溴铵在受体部位的驻留时间短, 较 快地离开 M2 受体, 体现了动力学选择过程。图 5c 是噻托溴铵与 M3 和 M2 结合与离解过程的自由能变 化图, 与M3的复合物过渡态自由能高于M2, 显示出 慢离解特征[9]。 4.3 利用去水合位点的分子再设计 去水合位点 (dehydrons) 是蛋白质结构域中比较常见的现象, 它 的发生是当可溶性蛋白在空间排布构成高级结构时, 在不相邻的氨基酸残基之间可形成氢键 N-H…O=C, 如果由于所处的环境使该氢键一部分被水合、一部分 被疏水性基团包围, 这样的氢键就不太稳定, 被认为 是有缺陷的氢键, 这种氢键具有亲近疏水基团、“挤 走”水分子的趋势, 因为氢键在疏水环境中更加稳 定。去水合位点具有趋近、吸引和融合非极性基团的 倾向, 易于接近配体的非极性基团, 因而利用存在的 去水合位点在原有配体 (或药物) 的基础上可设计 新的配体分子 (redesign), 从而提高选择性, 降低脱 靶作用[10]。 利用水合位点进行重新设计的一个实例, 是对 抗肿瘤药物伊马替尼 (1) 结构的再优化。前已述及, 伊马替尼是抑制 Bcr-Abl 和 c-Kit 激酶的抗肿瘤药物, 但由于脱靶作用而抑制心脏 c-Kit 激酶, 导致心肌细 胞的 ATP 枯竭, 引起心脏损伤。对伊马替尼分子的再 设计, 是利用 Bcr-Abl 和 c-Kit 激酶的结合部位存在 多个去水合位点, 其中 Bcr-Abl 的 Met318 与 Gly321 之间形成了完全被疏水包裹的氢键, 而在 c-Kit 激酶 结构域中的 Cys673 与 Gly676 生成的氢键是有缺陷 的去水合位点, 因而, 如果在伊马替尼接近 Cys673- Gly676 的部位加入疏水性基团, 有可能提高和改变 对 c-Kit 激酶的结合。图 6 是化合物 9 (WBZ_4, 在伊 马替尼的吡啶环上连接 4-甲基) 与 Bcr-Abl 和 c-Kit 激酶分子对接图, 甲基的引入干预了 c-Kit 去水合位 点, 提高了肿瘤细胞 c-Kit 激酶氢键的稳定性和结合 强度, 而对于心脏 c-Kit 的去水和位点影响小, 因而 提高了抑制肿瘤的选择性作用[11, 12]。 5 受体相互作用蛋白 1 激酶抑制剂的研究 本节所叙述的例子还未达到成药上市的阶段, 但从发现苗头和先导物、优化的理念和机制的论证, 所用的技术方法对于精准的药物研发有所借鉴[13]。 5.1 常规性普筛未能获得苗头化合物 受体相互作 用蛋白 1 激酶 (receptor interacting protein 1 kinase, RIP1) 是肿瘤坏死因子介导的炎症和病理过程的重 要驱动剂, 例如, 调控前炎性细胞因子的产生, 引起 细胞凋亡, 以及下调 TNF 受体 1 的表达等, 因而是最 近发现的治疗多种炎症的药物靶标。 为了发现先导物, GSK 公司首先用既往研发激酶 抑制剂所合成的化合物, 特别关注筛选结合于活性 环套的 DFG-out 构象的 2 型抑制剂, 进行了广泛的筛 选, 虽发现了活性化合物, 但由于分子尺寸大, 难以 图 6 4-甲基伊马替尼与 c-Kit 去水合位点 (绿色) 的疏水相互作用
郭宗儒:从精准医学谈药物设计的微观结构 优化,而且对其他激酶呈现泛抑制作用,故而未作深和富含甘氨酸环套的Phe28残基,从而定位了化合物 入研究。 15的结合模式。图7是基于光亲和标记的质谱分析 遂之用高通量方法筛选了200万个化合物,得到对化合物15与RIP1的分子模拟图,可以看出分子的 的苗头化合物经优化结构,化合物10有良好的体外两端苯并嗯氮草酮和苄基分别与两个环套的Serl61 活性与选择性,然而对小鼠的口服利用度低,成药的与Phe28发生结合。 前景渺茫,也终止了研究1 5.2筛选超大型DNA编码化合物库获得了有研发 前景的苗头化合物为了发现新的结构类型,GSK筛 选了自己构建的超大型DNA编码化学库DEL),大 约有77亿个结构多样性分子(关于用DNA片段作为 条形码分别标注和识别小分子化合物的DEL,其原 理与应用可参阅文献。从中只发现极少数具有苯 富甘氨酸环套 并嗯氮草酮为母核的分子,与RP1有特异性结合 由于结构类型与已知的激酶抑制剂完全不同,分析 其结构和成药性前景,认为有必要深入研究,遂合成图7分子模拟显示的化合物15与RP1的结合图 活化环套 了相关的化合物,其中11~13有较好的抑制RIPl 酶活性和细胞活性,11的活性(IC50酶=32 nmol L 进而还用同位素方法揭示15的结合特征。首先, IC0解=16mol1)强于12和13,进而合成11的RP1经氢一氘交换将肽链上的HN交换成DN后,质 对映体14(R构型)考察活性与构型的关系,结果表谱分析显示发生显著的变化的区域有:富含甘氨酸 明14的活性完全丧失(Cs>1000mo4-),提残基的环套、活化环套、C螺旋和铰链。与化合物15 示化合物的S构型具有特异性。 低温温孵的质谱分析结果表明,前3个区域的结合作 53优化S构型的化合物结构化合物15是11用减退,而铰链处质谱行为没有发生变化,推论化合 的N甲基化合物,进一步提高了活性(C50酶=13物15未同酶的铰链区结合 molL,ICs=10 nmol- L)。同时还测定了这些54化合物15与RP1的晶体结构图8是化合物 化合物的结合动力学性质,提示化合物15的离解速15与RIP1复合物晶体结构图,显示出化合物15埋藏 率显著低于其他化合物,12蜡合=11min(km=00015在C-端和N-端结构域之间的腔穴内,没有同铰链发 s-),进一步找到15高活性和高选择性的根据 生相互作用,证实了上述氢一氘交换质谱分析的推 为了确定化合物15与RIP结合的特征,测定了论。苯并嗯氮草酮环没有占据ATP的腺嘌呤位置,而 化合物的光亲和标记作用( photoaffinity label),分别是处于a磷酸基的区域。因而15与RIP1的结合方式 合成了在15的分子结构两端(与RP结合的重要位既不是1型抑制剂,也不是纯粹作用于变构位点的2 置)引入三氟甲基二氮杂环丙烷,后者在光作用下,型抑制剂,而属于激酶的3型抑制剂 开环形成活泼的亲电性基团,对邻近氨基酸残基加6其他 以标记。经LCMS分析表明与RIP1是1:1化学计 基于靶标结构的分子设计结合药物化学的构效 量性结合,被标记的位置分别是活化环套的Serl61关系分析,在研发激酶抑制剂领域得到广泛的应用, oo ll=(S);14=(R) oo N
郭宗儒: 从精准医学谈药物设计的微观结构 · 77 · 优化, 而且对其他激酶呈现泛抑制作用, 故而未作深 入研究。 遂之用高通量方法筛选了 200 万个化合物, 得到 的苗头化合物经优化结构, 化合物 10 有良好的体外 活性与选择性, 然而对小鼠的口服利用度低, 成药的 前景渺茫, 也终止了研究[14]。 5.2 筛选超大型 DNA 编码化合物库获得了有研发 前景的苗头化合物 为了发现新的结构类型, GSK筛 选了自己构建的超大型 DNA 编码化学库 (DEL), 大 约有 77 亿个结构多样性分子 (关于用 DNA 片段作为 条形码分别标注和识别小分子化合物的 DEL, 其原 理与应用可参阅文献[15])。从中只发现极少数具有苯 并噁氮䓬酮为母核的分子, 与 RIP1 有特异性结合。 由于结构类型与已知的激酶抑制剂完全不同, 分析 其结构和成药性前景, 认为有必要深入研究, 遂合成 了相关的化合物, 其中 11～13 有较好的抑制 RIP1 酶活性和细胞活性, 11 的活性 (IC50 酶 = 32 nmol·L −1 ; IC50 细胞 = 16 nmol·L −1 ) 强于 12 和 13, 进而合成 11 的 对映体 14 (R 构型), 考察活性与构型的关系, 结果表 明 14 的活性完全丧失 (IC50 酶 > 10 000 nmol·L −1 ), 提 示化合物的 S 构型具有特异性。 5.3 优化 S-构型的化合物结构 化合物 15 是 11 的 N-甲基化合物, 进一步提高了活性 (IC50 酶 = 1.3 nmol·L −1 ; IC50 细胞 =10 nmol·L −1 ) 。同时还测定了这些 化合物的结合动力学性质, 提示化合物 15 的离解速 率显著低于其他化合物, t1/2 结合 = 11 min (koff = 0.001 5 s −1 ), 进一步找到 15 高活性和高选择性的根据。 为了确定化合物 15 与 RIP1 结合的特征, 测定了 化合物的光亲和标记作用 (photoaffinity label), 分别 合成了在 15 的分子结构两端 (与 RIP1 结合的重要位 置) 引入三氟甲基二氮杂环丙烷, 后者在光作用下, 开环形成活泼的亲电性基团, 对邻近氨基酸残基加 以标记。经 LC-MS 分析表明与 RIP1 是 1∶1 化学计 量性结合, 被标记的位置分别是活化环套的 Ser161 和富含甘氨酸环套的 Phe28 残基, 从而定位了化合物 15 的结合模式。图 7 是基于光亲和标记的质谱分析 对化合物 15 与 RIP1 的分子模拟图, 可以看出分子的 两端苯并噁氮䓬酮和苄基分别与两个环套的 Ser161 与 Phe28 发生结合。 图 7 分子模拟显示的化合物 15 与 RIP1 的结合图 进而还用同位素方法揭示 15 的结合特征。首先, RIP1 经氢−氘交换将肽链上的 H-N 交换成 D-N 后, 质 谱分析显示发生显著的变化的区域有: 富含甘氨酸 残基的环套、活化环套、C 螺旋和铰链。与化合物 15 低温温孵的质谱分析结果表明, 前 3 个区域的结合作 用减退, 而铰链处质谱行为没有发生变化, 推论化合 物 15 未同酶的铰链区结合。 5.4 化合物 15 与 RIP1 的晶体结构 图 8 是化合物 15 与 RIP1 复合物晶体结构图, 显示出化合物 15 埋藏 在 C-端和 N-端结构域之间的腔穴内, 没有同铰链发 生相互作用, 证实了上述氢−氘交换质谱分析的推 论。苯并噁氮䓬酮环没有占据 ATP 的腺嘌呤位置, 而 是处于 α 磷酸基的区域。因而 15 与 RIP1 的结合方式 既不是 1 型抑制剂, 也不是纯粹作用于变构位点的 2 型抑制剂, 而属于激酶的 3 型抑制剂。 6 其他 基于靶标结构的分子设计结合药物化学的构效 关系分析, 在研发激酶抑制剂领域得到广泛的应用
药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2017,52(1):71-79 H3C NH 晚期乳腺癌疗效显著,有望获得批准上市。靶向药物 的研制为患者的个体化治疗提供了有针对性选择 7小结与展望 精准医学是在大数据网络时代和深化的分子医 学相结合而产生的新的医疗理念,药物作为治疗手 段的供应侧,对其品质提出了更高更精确的要求。在 这方面最近出现的肿瘤免疫疗法可谓精准医疗的尝 试,把靶标蛋白的生理特征与抗原一抗体的结构高度 互补性相结合,克服了技术上一道道难关实现了某 些肿瘤治疗的颠覆性的突破。尽管对抗原-抗体结合 图8化合物15与RIP1晶体衍射图 的三维结构尚不清晰,但划时代的疗效引领了精准 并有诸多的成功范例。例如针对黑色素瘤高表达的 医学的实施和革新 BRa变异激酶研发的维罗非尼(16, emura- 小分子药物的精准设计与此不同,更依赖于对 enb)。靶标为间充质上皮转化因子激酶(c-Met)在肿 靶标的功能和三维结构的清晰了解,通过基于结构 瘤细胞中变异和高表达,克唑替尼(17, crizotinib) 的药物设计(SBDD)、结构生物学、分子模拟和构效 不仅抑制c-Met,还抑制ALK蛋白激酶,结合探针 分析(SAR等,对分子的微观结构做到“精雕细刻” 性试剂盒的应用对于ALK呈阳性表达的小细胞肺癌 的优化,同时将微观结构完全融汇到分子的宏观性 质中,满足物理化学和药代动力学(ADME)性质的 患者具有特异性治疗作用。诺华公司为克服伊马替 尼治疗慢性粒细胞白血病而产生的耐药性,针对变 要求。其中药物对靶标组织或器官的特异性分布(D) 异的激酶Bcr-Abll3,成功研制了第二代的抗耐药 仍属于药代的瓶颈,是分子设计的盲区,处于“打哪 抑制剂尼洛替尼(18, nilotinib)。针对在B细胞抗原指哪儿”的宿命状态。以代谢组学为切入点,也是 受体的信号通路中起重要作用的 Bruton酪氨酸激酶 精确药物设计和应用的重要领域。所以,从更宽的视 野考量药物,最终体现在优于现有的标准治疗方法。 (BTK),成功设计的BTK激酶抑制剂依鲁替尼(19, ibrutinib),治疗B细胞恶性增生和风湿性关节炎,该新药研究任重道远。 药物的分子结构中含有迈克尔加成基团,接近于激 Ref 酶开口处的Cys481,与亲核性基团巯基发生共价结 [1 Cowan-Jacob sw, Guez V, Fendrich Gi, et al. Imatinib 合,提高了选择性作用。诺华公司研制的另一个靶向 (STI571)resistance in chronic myelogenous leukemia 药物 ribociclib(20)是细胞周期蛋白依赖性激酶4和 olecular basis of the underlying mechanisms and potential 6(CDK4/6)双重抑制剂,对激素成阳性(HR+)和 strategies for treatment ]. Mini-Rev Med Chem, 2004, 4: 表皮生长因子受体2呈阴性(HER2-)的绝经期妇女 285-299
· 78 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (1): 71 −79 图 8 化合物 15 与 RIP1 晶体衍射图 并有诸多的成功范例。例如针对黑色素瘤高表达的 B-RafV600E 变异激酶研发的维罗非尼 (16, vemurafenib)。靶标为间充质上皮转化因子激酶 (c-Met) 在肿 瘤细胞中变异和高表达, 克唑替尼 (17, crizotinib) 不仅抑制 c-Met, 还抑制 ALK 蛋白激酶, 结合探针 性试剂盒的应用对于 ALK 呈阳性表达的小细胞肺癌 患者具有特异性治疗作用。诺华公司为克服伊马替 尼治疗慢性粒细胞白血病而产生的耐药性, 针对变 异的激酶 Bcr-AblM315I , 成功研制了第二代的抗耐药 抑制剂尼洛替尼 (18, nilotinib)。针对在 B 细胞抗原 受体的信号通路中起重要作用的 Bruton 酪氨酸激酶 (BTK), 成功设计的 BTK 激酶抑制剂依鲁替尼 (19, ibrutinib), 治疗 B 细胞恶性增生和风湿性关节炎, 该 药物的分子结构中含有迈克尔加成基团, 接近于激 酶开口处的 Cys481, 与亲核性基团巯基发生共价结 合, 提高了选择性作用。诺华公司研制的另一个靶向 药物 ribociclib (20) 是细胞周期蛋白依赖性激酶 4 和 6 (CDK4/6) 双重抑制剂, 对激素成阳性 (HR+) 和 表皮生长因子受体 2 呈阴性 (HER2−) 的绝经期妇女 晚期乳腺癌疗效显著, 有望获得批准上市。靶向药物 的研制为患者的个体化治疗提供了有针对性选择。 7 小结与展望 精准医学是在大数据网络时代和深化的分子医 学相结合而产生的新的医疗理念, 药物作为治疗手 段的供应侧, 对其品质提出了更高更精确的要求。在 这方面最近出现的肿瘤免疫疗法可谓精准医疗的尝 试, 把靶标蛋白的生理特征与抗原−抗体的结构高度 互补性相结合, 克服了技术上一道道难关实现了某 些肿瘤治疗的颠覆性的突破。尽管对抗原−抗体结合 的三维结构尚不清晰, 但划时代的疗效引领了精准 医学的实施和革新。 小分子药物的精准设计与此不同, 更依赖于对 靶标的功能和三维结构的清晰了解, 通过基于结构 的药物设计 (SBDD)、结构生物学、分子模拟和构效 分析 (SAR等, 对分子的微观结构做到“精雕细刻” 的优化, 同时将微观结构完全融汇到分子的宏观性 质中, 满足物理化学和药代动力学 (ADME) 性质的 要求。其中药物对靶标组织或器官的特异性分布 (D) 仍属于药代的瓶颈, 是分子设计的盲区, 处于“打哪 儿指哪儿”的宿命状态。以代谢组学为切入点, 也是 精确药物设计和应用的重要领域。所以, 从更宽的视 野考量药物, 最终体现在优于现有的标准治疗方法。 新药研究任重道远。 References [1] Cowan-Jacob SW, Guez V, Fendrich G, et al. Imatinib (STI571) resistance in chronic myelogenous leukemia: molecular basis of the underlying mechanisms and potential strategies for treatment [J]. Mini-Rev Med Chem, 2004, 4: 285−299
郭宗儒:从精准医学谈药物设计的微观结构 [2] Huang WS, Metcalf CA, Sundaramoorthi R, et al. Discovery [8] quelin G Charlton SJ. Long-lasting target binding and of 3-2-(imidazo[ 1, 2-b ]pyridazin-3-yl)ethynyl]-4-methyl-N-44. rebinding echanisms to prolong in vivo drug action J Br J Pharmacol. 2010. 161: 488 potent, o [9 Kruse AC, Hu X, Kobilka BK, et al. Muscarinic acetylcho- breakpoint cluster region-abelson(BCR-ABL) kinase including line receptor X-ray structures: potential implications for drug the T315I gatekeeper mutant []. J Med Chem, 2010, 53: development [] Curr Opin Pharmacol, 2014, 16: 24-30 [10 Fernades A, Scott R. Dehyd 3] Tie YPl, Boross YF, Wang L, et al. High resolution crystal signal for protein interaction []. Biophys J, 2003, 85: 1914 structures of HIV-l protease with a potent non-peptide inhibitor (UlC-94017)active against multidrug- resistant clinical strains [11 Demetri GD. Structural reengineering of imatinib to decrease - J Mol Biol,2004,38:34l-352 ardiac risk in cancer therapy []. J Clin Invest, 2007, 117 14] Leonis G Czyznikowska Z, Megariotis G Computational 3650-3653 studies of darunavir into HIV-1 protease and dMPC bilayer [12 Fernandez A, SanguinoA, Peng Z, et al. An anticancer c-Kit kinase inhibitor is reengineered to make it more active and less flaps []. J Chen Inf Model, 2012, 52: 1542-1558 cardiotoxic [ J]. J Clin Invest, 2007, 117: 4044-4054 [5] Deng H, Sun H, Fang Y. Label-free cell phenotypic assessment [13 Harris PA, King BW, Bandyopadhyay D, et al. DNA-encoded of the biased agonism and efficacy of agonists at the endogenous library screening identifies benzo[b][ 1, 4 ]oxazepin-4-ones as M3 receptors J]. J Pharmacol Toxicol Methods, highly potent and monoselective receptor interacting protein I 2013,68:323-333 kinase inhibitors ] J Med Chem, 2016, 59: 2163-2178 6] Matthews PM, Rabiner EA, Passchier J, et al. Positron [14 Berger SB, Hamis P, Nagilla R, et al. Characterization of emission tomography molecular imaging or drug development GSK963: a structurally distinct, potent and selective inhibitor of U]. Br J Clin Pharmacol, 2012, 73: 175-186 RIPI kinase [J]. Cell Death Discov, 2015, 1: 15009 [7 Schneider EV, Bottcher J, Huber R, et al. Structure-kinetic [15] Arico-Muendel CC. From haystack to needle: finding value relationship study of CDK8/CycC speci fic compounds with DNA encoded library technology at GSk []. Med Chem Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110: 8081-8086. Commun,2016.DO:10.1039C6MD00341A
郭宗儒: 从精准医学谈药物设计的微观结构 · 79 · [2] Huang WS, Metcalf CA, Sundaramoorthi R, et al. Discovery of 3-[2-(imidazo[1,2-b]pyridazin-3-yl)ethynyl]-4-methyl- N-{4- [(4-methylpiperazin-1-yl)-methyl]-3-(trifluoromethyl)phenyl} benzamide (AP24534), a potent, orally active pan-inhibitor of breakpoint cluster region-abelson (BCR-ABL) kinase including the T315I gatekeeper mutant [J]. J Med Chem, 2010, 53: 4701−4719. [3] Tie YPI, Boross YF, Wang L, et al. High resolution crystal structures of HIV-1 protease with a potent non-peptide inhibitor (UIC-94017) active against multidrug-resistant clinical strains [J]. J Mol Biol, 2004, 338:341 −352. [4] Leonis G, Czyznikowska Z, Megariotis G. Computational studies of darunavir into HIV-1 protease and DMPC bilayer: necessary conditions for effective binding and the role of the flaps [J]. J Chen Inf Model, 2012, 52: 1542 −1558. [5] Deng H, Sun H, Fang Y. Label-free cell phenotypic assessment of the biased agonism and efficacy of agonists at the endogenous muscarinic M3 receptors [J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2013, 68: 323−333. [6] Matthews PM, Rabiner EA, Passchier J, et al. Positron emission tomography molecular imaging or drug development [J]. Br J Clin Pharmacol, 2012, 73: 175 −186. [7] Schneider EV, Böttcher J, Huber R, et al. Structure-kinetic relationship study of CDK8/CycC speci fic compounds [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110: 8081−8086. [8] Vauquelin G, Charlton SJ. Long-lasting target binding and rebinding as mechanisms to prolong in vivo drug action [J]. Br J Pharmacol, 2010, 161: 488 −508. [9] Kruse AC, Hu JX, Kobilka BK, et al. Muscarinic acetylcholine receptor X-ray structures: potential implications for drug development [J]. Curr Opin Pharmacol, 2014, 16: 24 −30. [10] Fernades A, Scott R. Dehydron: a structurally encoded signal for protein interaction [J]. Biophys J, 2003, 85: 1914 − 1928. [11] Demetri GD. Structural reengineering of imatinib to decrease cardiac risk in cancer therapy [J]. J Clin Invest, 2007, 117: 3650−3653. [12] Fernández A, SanguinoA, Peng Z, et al. An anticancer c-Kit kinase inhibitor is reengineered to make it more active and less cardiotoxic [J]. J Clin Invest, 2007, 117: 4044 −4054. [13] Harris PA, King BW, Bandyopadhyay D, et al. DNA-encoded library screening identifies benzo[b][1,4]oxazepin-4-ones as highly potent and monoselective receptor interacting protein 1 kinase inhibitors [J]. J Med Chem, 2016, 59: 2163 −2178. [14] Berger SB, Harris P, Nagilla R, et al. Characterization of GSK′963: a structurally distinct, potent and selective inhibitor of RIP1 kinase [J]. Cell Death Discov, 2015, 1: 15009. [15] Arico-Muendel CC. From haystack to needle: finding value with DNA encoded library technology at GSK [J]. Med Chem Commun, 2016. DOI: 10.1039/C6MD00341A