药学学报：《药物化学》教学资源（阅读资料）基于酶结构设计的个体化治疗药物克里唑替尼

药学学报 Acta pharmaceutica sinica2016,51(4)672-676 新药发现与研究实例简析 新药创制是复杂的智力活动,涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效罘等多维科技活动。每个药物 都有自身的研发轨迹,而构建化学结构是最重要的环节,因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。 本栏目以药物化学视角,对有代表性的药物的成功构建,加以剖析和解读 审视克里唑替尼的研发历程,有几个鲜明的特点:由苗头过渡到先导物是以药物化学和构效关系为策略进 行的;先导物的优化则是在复合物晶体结构导引下进行“量体裁衣”式的结构剪裁和安排,得以使组成分子的片 段适配于结合位点;为了使活性和成药性得以并举优化,用亲脂性效率“监视”和比较化合物的质量。克里唑替 尼的幸运还在于基于c-Met激酶结构设计,却也对ALK激酶有强效抑制作用,因而作为双靶标药物,成为对 于ALK呈阳性表达的小细胞肺癌患者特异性治疗药物。结合探针试剂盦的应用,标志着个体化治疗的又一突 (编者按) DO:10.16438/0513-4870.20140856 基于酶结构设计的个体化治疗药物克里唑替尼 郭宗儒 (中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所,北京100050) 1研发c-Met抑制剂一从苗头到先导化合物 激酶的活性高达ICs0=10 noll-,在1 umol- L浓 L.Ic-Met是抗肿瘤药物的靶标 度下可因抑制c-Met而完全阻止了A549细胞的生长。 辉瑞公司于2006年上市了舒尼替尼(1, sunitinib), 由于1对多种酪氨酸激酶( VEGFR、 PDGFR和KIT) 的抑制作用,得以治疗对伊马替尼耐药的胃肠道间 质瘤(GIST)患者。循此研发路径,公司也着手研究 与肿瘤相关的其他激酶的药物 间充质上皮转化因子激酶(c-Met)也是受体酪 氨酸激酶,它的天然配体是肝细胞生长因子(HGF 又称扩散因子,其信号通路对发育、器官形成和机体 为了提高苗头对c-Met激酶的选择性作用,分别 稳态起重要作用。当cMet被HGF激活,引发细胞增在母核的两个位置进行修饰,一是在4位连接(取代 殖、迁移、浸润和分支形态发生等浸染过程。许多实的)苯基,另一是在5位连接(取代的)苄基磺酰基 体瘤的c-Met的畸变和过度表达,发生结构性活化、侧链。通式3在苯环上R1为一个或两个简单取代基, 基因放大和突变,因此cMet被认为是肿瘤药物治疗酰胺基侧链大都连接在4位或3位R2多为叔或仲氮 的分子靶标。 原子;R3为一个甲基时处于5位,酰胺侧链连接于3 1.2苗头化合物优化辉瑞研发cMet激酶抑制剂位,R3为2,5-二甲基时,酰胺侧链连接于4位。4苯基 仍以3-取代的吲哚啉-2-酮(或称羟基吲哚)为母核,吲哚林-2-酮系列(通式3)共合成并专利公布了43 这是因为该母核能以平面的方式进入激酶的结合位个实施例(合成的目标化合物可能更多),都程度不 点,提供形成两个氢键的元件:经环上的N-H和C=O同的显示了抑制cMet活性( Cui jr,etal.4- 可与激酶的ATP结合域发生氢键结合。在筛选已有 Aryl substituted indolinones.WO02/055517)。通式4 的化合物中发现苗头化合物2(SU-5402)抑制cMet的R1、R2和R3的含义与通式3相同,合成并专利公

· 672 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (4): 672 −676 ·新药发现与研究实例简析· 新药创制是复杂的智力活动, 涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物 都有自身的研发轨迹, 而构建化学结构是最重要的环节, 因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。 本栏目以药物化学视角, 对有代表性的药物的成功构建, 加以剖析和解读。 审视克里唑替尼的研发历程, 有几个鲜明的特点: 由苗头过渡到先导物是以药物化学和构效关系为策略进 行的; 先导物的优化则是在复合物晶体结构导引下进行“量体裁衣”式的结构剪裁和安排, 得以使组成分子的片 段适配于结合位点; 为了使活性和成药性得以并举优化, 用亲脂性效率“监视”和比较化合物的质量。克里唑替 尼的幸运还在于基于 c-Met 激酶结构设计, 却也对 ALK 激酶有强效抑制作用, 因而作为双靶标药物, 成为对 于 ALK 呈阳性表达的小细胞肺癌患者特异性治疗药物。结合探针试剂盒的应用, 标志着个体化治疗的又一突 破。 ( 编者按) DOI: 10.16438/j.0513-4870.2014-0856 基于酶结构设计的个体化治疗药物克里唑替尼 郭宗儒 (中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050) 1 研发 c-Met 抑制剂—从苗头到先导化合物 1.1 c-Met 是抗肿瘤药物的靶标 辉瑞公司于 2006 年上市了舒尼替尼 (1, sunitinib), 由于 1 对多种酪氨酸激酶 (VEGFR、PDGFR 和 KIT) 的抑制作用, 得以治疗对伊马替尼耐药的胃肠道间 质瘤 (GIST) 患者。循此研发路径, 公司也着手研究 与肿瘤相关的其他激酶的药物。 间充质上皮转化因子激酶 (c-Met) 也是受体酪 氨酸激酶, 它的天然配体是肝细胞生长因子 (HGF, 又称扩散因子), 其信号通路对发育、器官形成和机体 稳态起重要作用。当 c-Met 被 HGF 激活, 引发细胞增 殖、迁移、浸润和分支形态发生等浸染过程。许多实 体瘤的 c-Met 的畸变和过度表达, 发生结构性活化、 基因放大和突变, 因此 c-Met 被认为是肿瘤药物治疗 的分子靶标。 1.2 苗头化合物优化 辉瑞研发 c-Met 激酶抑制剂 仍以 3-取代的吲哚啉-2-酮 (或称羟基吲哚) 为母核, 这是因为该母核能以平面的方式进入激酶的结合位 点, 提供形成两个氢键的元件: 经环上的 N-H和 C=O 可与激酶的 ATP 结合域发生氢键结合。在筛选已有 的化合物中发现苗头化合物 2 (SU-5402) 抑制 c-Met 激酶的活性高达 IC50=10 nmol·L −1 , 在 1 μmol·L −1 浓 度下可因抑制 c-Met而完全阻止了 A549 细胞的生长。 为了提高苗头对 c-Met 激酶的选择性作用, 分别 在母核的两个位置进行修饰, 一是在 4 位连接 (取代 的) 苯基, 另一是在 5 位连接 (取代的) 苄基磺酰基 侧链。通式 3 在苯环上 R1 为一个或两个简单取代基; 酰胺基侧链大都连接在 4 位或 3 位, R2 多为叔或仲氮 原子; R3 为一个甲基时处于 5 位, 酰胺侧链连接于 3 位, R3 为 2,5-二甲基时, 酰胺侧链连接于 4 位。4-苯基 吲哚林-2-酮系列 (通式 3) 共合成并专利公布了 435 个实施例 (合成的目标化合物可能更多), 都程度不 同 的 显 示 了抑制 c-Met 活 性 (Cui JR, et al. 4- Aryl substituted indolinones. WO 02/055517)。通式 4 的 R1、R2 和 R3 的含义与通式 3 相同, 合成并专利公

郭宗儒:基于酶结构设计的个体化治疗药物克里唑替尼 布了375个实施例,也显示了抑制c-Met活性(Cui转折,占据了aC螺旋的催化位置,使得1228~12 JR,etal.5- Aralkylsulfony-3-( pyrrol-2- ylmethylidene)环套残基移位,干扰了ATP与底物的结合;②吲哚酮 2-indolinones as kinase inhibitors. wO02/096361) 的N-H和C=O基团与激酶铰链的残基分别形成氢键 ③吲哚酮的C=O与吡咯环的NH形成分子内氢键, N(CH2)2. 3R2 N(CH2)23R2 因而吲哚酮与吡咯环形成较大的共轭平面,处于ATP 的腺嘌呤环结合的平面裂隙处;④连接羟基吲哚与 二氯苯基的连接基磺酰亚甲基形成U-形转折,使二氯 代苄基与具有独特构象的A-环套上Tyr1230的苯酚 环发生ππ堆积作用;⑤磺酰基的氧原子与Asp12 13先导化合物在报道的近千个目的化合物中,化的NH形成氢键,稳定了分子取向;⑥与吡咯环相 合物5(PHA665752)显示对cMt激酶具有高选择连的酰胺及延伸的片段进入了水相,未与蛋白结合。 性活性,强于对其他激酶抑制活性的50倍以上;对高 上述结合的信息,为化合物5的结构改造与优化 表达cMet的细胞抑制活性ICo=9 nmoI-L,而且提供了微观性的依据。 显著抑制多株肿瘤细胞的生长、迁移和浸润;体内实 验显示5能抑制移植性肿瘤细胞的c-Met磷酸化,且 剂量依赖性地抑制肿瘤生长。5的物化和活性参数如 分子内氢键 下:相对分子质量为641.62,配体效率①LE)为0.25 (LE=由IC50换算成的结合自由能△G/非氢原子数 =准积作用 是联系化合物分子尺寸和与受体结合强度的量度 表示化合物的活性效率),亲脂性效率LipE为485 SO形液氢键 (LipE=pCso- clog,是联系化合物亲脂性和与受体 结合效率的量度,数值越大越趋近成药性),分布系 数logD=320(于pH74测定)。这些数据表明5可作 为候选化合物进入开发阶段。 然而,5的相对分子质量偏大,尽管结构中含有 成盐性基团,但成盐后溶解性仍差,在pH74缓冲液图1A:化合物5与cMet激酶结合域共结晶的结构图 中溶解度为09gmL。此外5在大鼠体内有较高B:结合的简化图 的代谢清除率,CL=77 mL min.kg,这些不利的物 化和药代性质,表明不宜作为候选药物进一步研发 基于酶结构的分子设计 因而将5作为先导物进行结构优化。优化的目标是在 3.1骨架迁越——母核的优化吲哚环经磺酰亚甲 保持对cMet激酶和细胞的高抑制活性和选择性的前基与二氯苯基相连,二氯苯基为了与Tyr1230发生 提下,降低分子尺寸,以改善物化和药代性质。 重要的π-π堆积,磺酰亚甲基还得作U形转折,说明 连接链-SO2-CH2-的长度有些冗赘,加之吲哚酮与吡 咯环形成过大的共轭平面,提示化合物5的骨架有不 足之处,须加以缩小变换。 采用骨架迁越方法,用可提供两个氢键结合的 小尺寸平面结构替换吲哚酮-吡咯母核,以便适配于 较小的嘌呤结合腔,并保持形成氢键能力;同时缩短 连接基,消除形成U形转折的熵损失,使二氯苯基更 2结构生物学揭示复合物的微观结合特征 有利于与Tyr1230发生相互作用,将整个分子尺寸降 化合物5与c-Met激酶(未被磷酸化的结合域)低下来。 的复合物晶体结构表明有如下结合特征(图1):①结 在骨架变迁中经历了数个阶段:将5的吲哚酮 合域的A环套(A-op)采取了独特的自身抑制状态与吡咯的分子内氢键“固化”成共价键,为氮杂吖 的构象,即在激酶的活化环套残基1222~1227形成啶6,此时吡咯的NH与吡啶的N分别提供氢键的给

郭宗儒: 基于酶结构设计的个体化治疗药物克里唑替尼 · 673 · 布了 375 个实施例, 也显示了抑制 c-Met 活性 (Cui JR, et al. 5-Aralkylsulfonyl-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)- 2-indolinones as kinase inhibitors. WO 02/096361)。 1.3 先导化合物 在报道的近千个目的化合物中, 化 合物 5 (PHA-665752) 显示对 c-Met 激酶具有高选择 性活性, 强于对其他激酶抑制活性的 50 倍以上; 对高 表达 c-Met 的细胞抑制活性 IC50 = 9 nmol·L −1 , 而且 显著抑制多株肿瘤细胞的生长、迁移和浸润; 体内实 验显示 5 能抑制移植性肿瘤细胞的 c-Met 磷酸化, 且 剂量依赖性地抑制肿瘤生长。5 的物化和活性参数如 下: 相对分子质量为 641.62, 配体效率 (LE) 为 0.25 (LE = 由 IC50 换算成的结合自由能 ΔG/非氢原子数, 是联系化合物分子尺寸和与受体结合强度的量度, 表示化合物的活性效率), 亲脂性效率 LipE 为 4.85 (LipE = pIC50 − clogD, 是联系化合物亲脂性和与受体 结合效率的量度, 数值越大越趋近成药性), 分布系 数 logD=3.20 (于 pH 7.4 测定)。这些数据表明 5 可作 为候选化合物进入开发阶段。 然而, 5 的相对分子质量偏大, 尽管结构中含有 成盐性基团, 但成盐后溶解性仍差, 在 pH 7.4 缓冲液 中溶解度为 0.9 μg·mL−1。此外 5 在大鼠体内有较高 的代谢清除率, CL=77 mL·min−1 ·kg−1 , 这些不利的物 化和药代性质, 表明不宜作为候选药物进一步研发, 因而将 5 作为先导物进行结构优化。优化的目标是在 保持对 c-Met激酶和细胞的高抑制活性和选择性的前 提下, 降低分子尺寸, 以改善物化和药代性质。 2 结构生物学揭示复合物的微观结合特征 化合物 5 与 c-Met 激酶 (未被磷酸化的结合域) 的复合物晶体结构表明有如下结合特征 (图 1): ① 结 合域的 A-环套 (A-loop) 采取了独特的自身抑制状态 的构象, 即在激酶的活化环套残基 1222～1227 形成 转折, 占据了 αC 螺旋的催化位置, 使得 1228～1245 环套残基移位, 干扰了 ATP 与底物的结合; ② 吲哚酮 的 N-H 和 C=O 基团与激酶铰链的残基分别形成氢键; ③ 吲哚酮的 C=O 与吡咯环的 N-H 形成分子内氢键, 因而吲哚酮与吡咯环形成较大的共轭平面, 处于 ATP 的腺嘌呤环结合的平面裂隙处; ④ 连接羟基吲哚与 二氯苯基的连接基磺酰亚甲基形成 U-形转折, 使二氯 代苄基与具有独特构象的 A-环套上 Tyr1230 的苯酚 环发生 π-π 堆积作用; ⑤ 磺酰基的氧原子与 Asp1222 的 N-H 形成氢键, 稳定了分子取向; ⑥ 与吡咯环相 连的酰胺及延伸的片段进入了水相, 未与蛋白结合。 上述结合的信息, 为化合物 5 的结构改造与优化 提供了微观性的依据。 图 1 A: 化合物 5 与 c-Met 激酶结合域共结晶的结构图; B: 结合的简化图 3 基于酶结构的分子设计 3.1 骨架迁越——母核的优化 吲哚环经磺酰亚甲 基与二氯苯基相连, 二氯苯基为了与 Tyr-1230 发生 重要的 π-π 堆积, 磺酰亚甲基还得作 U 形转折, 说明 连接链-SO2-CH2-的长度有些冗赘, 加之吲哚酮与吡 咯环形成过大的共轭平面, 提示化合物 5 的骨架有不 足之处, 须加以缩小变换。 采用骨架迁越方法, 用可提供两个氢键结合的 小尺寸平面结构替换吲哚酮−吡咯母核, 以便适配于 较小的嘌呤结合腔, 并保持形成氢键能力; 同时缩短 连接基, 消除形成 U 形转折的熵损失, 使二氯苯基更 有利于与 Tyr1230 发生相互作用, 将整个分子尺寸降 低下来。 在骨架变迁中经历了数个阶段: 将 5 的吲哚酮 与吡咯的分子内氢键“固化”成共价键, 为氮杂吖 啶 6, 此时吡咯的 NH 与吡啶的 N 分别提供氢键的给

674 药学学报 Acta pharmaceutica sinica2016,51(4)672-676 体和接受体,母核+连接基的非氢原子数由原来的22关系,表明随着苯环上亲脂性的增加,提高了抑制活 降到17,继之切断C-N键形成2-氨基-3-苯基吡啶化性 合物7(非氢原子数仍为17),此时2-氨基吡啶提供氢 连接基上R为甲基取代比未被取代的相应化合 键的给体和接受体,再简化连接基,用氧原子替换磺物活性高,提示甲基取代有利于提高活性。其中化合 酰苯基,成为化合物8,非氢原子数降低到9。 物12活性最高,对c-Met酶的活性参数为:K1=0012 32新骨架的首轮优化化合物8对cMet激酶的molL,LipE=482;对c-Met细胞的活性参数为 K值3.83μmolL-,活性虽然较弱,但因相对分子质1Cs0=0.020 umol.L,Lip=460 量低,配体效率仍不错,LE=0.29,高于化合物3,但 亲脂性效率降低到LipE=0.35,显然是因活性低的缘 故。8的苯环上留有羟基,成为引出极性侧链的“端 口”,连接吗啉亚乙基得到化合物9,活性略有提高, K1=245μmolL,但因分子尺寸加大,配体效率降 低。进而加长并模仿化合物3的末端片段,化合物10 的K=046molL,LE=0.24,LjpE=3.70,提高了抑 制活性和亲脂性效率。 ./N B-F LipE=4 氨基吡啶系列的化合物与cMet的复合物晶体图2苯环与连接基变换与活性和亲脂性效率的关系 表明,氨基和吡啶的N原子分别与铰链形成氢键,由 于缩短了连接基,使得二氯苯基容易同环套A上的3.45苯环的变换——5吡唑环系的确定研发至 Tr1230发生xz相互作用,苯甲酰基连接的片段进此,以化合物2为代表的三卤代苯和连接基的化合 入水相中,但不同的片段活性不同,例如化合物10物达到最佳优化状态,下一步是在保持活性和选择 的活性是9的5倍,表明虽然亲水性片段进入了水相,性前提下,优化物理化学和药代动力学性质。根据复 没有同酶结合,但却影响了分子的结合。 合物的晶体结构,5-苯基结合于Tyrl159、Ilel084和 33二氯苯基的取代基的变换和连接基亚甲基的甲Gly1163构成的疏水性狭窄裂隙,这需要确保在氨基 基取代氨基吡啶骨架系列的二氯苯基与A环套的吡啶的5位连接的芳环具有平面性,芳基上连接的基 Tyr1230的苯酚基发生ππ堆积结合,为了考察环上取团(片段)延伸到溶剂相中。此外,12中的酰胺片段 代基对活性K1和亲脂性效率LipE的影响,合成了通已离开疏水裂隙,进入水相,提示延伸的亲水性片段 式11的化合物,式中R代表一个、两个或三个相同可不必经酰胺键连接 或不同的原子或基团,R为H或甲基,测定化合物对 用五元含氮芳环替换5-苯环可增加水溶性,例 cMet激酶的pK值,计算分子的亲脂性参数 CLOg如含5-吡唑或咪唑化合物的 CLOg比相应的苯化合 值,将各化合物的活性pK值与 CLog作图,图2表物低2个单位,并且较小扭角(减少了迫位效应),增 示了有代表性的化合物的活性与亲脂性效率LjpE的加了共面性,有利于结合

· 674 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (4): 672 −676 体和接受体, 母核+连接基的非氢原子数由原来的 22 降到 17; 继之切断 C-N 键形成 2-氨基-3-苯基吡啶化 合物 7 (非氢原子数仍为 17), 此时 2-氨基吡啶提供氢 键的给体和接受体, 再简化连接基, 用氧原子替换磺 酰苯基, 成为化合物 8, 非氢原子数降低到 9。 3.2 新骨架的首轮优化 化合物 8 对 c-Met 激酶的 Ki 值 3.83 μmol·L −1 , 活性虽然较弱, 但因相对分子质 量低, 配体效率仍不错, LE = 0.29, 高于化合物 3, 但 亲脂性效率降低到 LipE = 0.35, 显然是因活性低的缘 故。8 的苯环上留有羟基, 成为引出极性侧链的“端 口”, 连接吗啉亚乙基得到化合物 9, 活性略有提高, Ki = 2.45 μmol·L −1 , 但因分子尺寸加大, 配体效率降 低。进而加长并模仿化合物 3 的末端片段, 化合物 10 的 Ki=0.46 μmol·L −1 , LE=0.24, LipE =3.70, 提高了抑 制活性和亲脂性效率。 氨基吡啶系列的化合物与 c-Met 的复合物晶体 表明, 氨基和吡啶的 N 原子分别与铰链形成氢键, 由 于缩短了连接基, 使得二氯苯基容易同环套 A 上的 Tyr1230 发生 π-π 相互作用, 苯甲酰基连接的片段进 入水相中, 但不同的片段活性不同, 例如化合物 10 的活性是 9 的 5 倍, 表明虽然亲水性片段进入了水相, 没有同酶结合, 但却影响了分子的结合。 3.3 二氯苯基的取代基的变换和连接基亚甲基的甲 基取代 氨基吡啶骨架系列的二氯苯基与 A 环套的 Tyr1230 的苯酚基发生 π-π 堆积结合, 为了考察环上取 代基对活性 Ki 和亲脂性效率 LipE 的影响, 合成了通 式 11 的化合物, 式中 R 代表一个、两个或三个相同 或不同的原子或基团, R'为 H 或甲基, 测定化合物对 c-Met 激酶的 pKi 值, 计算分子的亲脂性参数 cLogD 值, 将各化合物的活性 pKi 值与 cLogD 作图, 图 2 表 示了有代表性的化合物的活性与亲脂性效率 LipE 的 关系, 表明随着苯环上亲脂性的增加, 提高了抑制活 性。 连接基上 R'为甲基取代比未被取代的相应化合 物活性高, 提示甲基取代有利于提高活性。其中化合 物 12 活性最高, 对 c-Met 酶的活性参数为: Ki=0.012 μmol·L −1 , LipE = 4.82; 对 c-Met 细胞的活性参数为: IC50=0.020 μmol·L −1 , LipE=4.60。 图 2 苯环与连接基变换与活性和亲脂性效率的关系 3.4 5-苯环的变换 ——5-吡唑环系的确定 研发至 此, 以化合物 12 为代表的三卤代苯和连接基的化合 物达到最佳优化状态, 下一步是在保持活性和选择 性前提下, 优化物理化学和药代动力学性质。根据复 合物的晶体结构, 5-苯基结合于 Tyr1159、Ile1084 和 Gly1163 构成的疏水性狭窄裂隙, 这需要确保在氨基 吡啶的 5 位连接的芳环具有平面性, 芳基上连接的基 团 (片段) 延伸到溶剂相中。此外, 12 中的酰胺片段 已离开疏水裂隙, 进入水相, 提示延伸的亲水性片段 可不必经酰胺键连接。 用五元含氮芳环替换 5-苯环可增加水溶性, 例 如含 5-吡唑或咪唑化合物的 cLogD 比相应的苯化合 物低 2 个单位, 并且较小扭角 (减少了迫位效应), 增 加了共面性, 有利于结合

郭宗儒:基于酶结构设计的个体化治疗药物克里唑替尼 氨基吡啶与吡唑环的连接方式对活性影响很大, 例如化合物13和14的活性(酶的K1和细胞的ICs0) 以及LipE值相差很大。结构生物学表明,13的吡唑 环氮原子所处的位置使得c-Met的残基Metl160和 Il084取向与吡唑环邻近,不利于氨基吡啶的氢键 4克里唑替尼的作用特征 结合,而且该吡唑环处于酶蛋白的疏水性界面,为了41克里唑替尼的物化和活性参数以化合物5为 发生疏水疏水相互作用,N原子的孤电子对的去水先导化合物成功研制出克里唑替尼18,体现了结构 合作用是不利的格变,而14的N原子都进入了水相,生物学和药物化学结合应用的成果,表1比较了化合 没有上述的不利效应,因而活性高于13,酶或细胞活物5和18的物化和生物学参数在优化的路径上,相 性提高了30~40倍。化合物14的N甲基化后产物对分子质量降低了191(30%),表征亲脂性的分布系 15的活性更强,提示由这个N原子可引出含有极性数降低了1.3个对数单位(20倍),对cMet细胞的抑 基团的碳链,以提高活性水溶性。 制活性没变,亲脂性效率增加了1.3个对数单位 3.5N取代的吡唑化合物的优化鉴于化合物10结 构中含有延伸到水相的碱性基团能够提高活性和亲表1化合物5与18的物化性质和活性参数的比较 脂性效率,因而也在吡咯环系上引入尽可能小的碱 化合物相对分 s子质量 LogD ICso/nmol-L-I LE LipE cMet细胞 性片段,例如链烷基叔胺、氮杂环丁烷、四氢吡咯 (ICso) 哌啶等,以增加活性和改善药学和药代性质。在选择 641.623.20 8 450.34 1.96 0.386.14 高活性(酶和细胞)和高亲脂性效率的化合物同时, 还评价对人肝微粒体(HLM)的稳定性,从有代表性42克里唑替尼与cMet结合特征克里唑替尼 的化合物中优选出16和17,尤其是因17的高活性和(化合物18)与c-Met的复合物晶体结构表明,其结 较好的代谢稳定性,确定为候选药物。 合模式与3基本相同。∝-甲基苄基与c-Met的环套A 3.6光学活性的候选药物——克里唑替尼的成功前发生相互作用,不仅有助于苄基的定位,而且增加了 述优化过程制备的吡唑系列化合物含有手性碳原子,与疏水腔(由Va92、Leu17、Lys10和 AlalI 都是用混旋的样品测定活性的。将优选出的化合物17的侧链构成)发生的疏水相互作用,甲基处于R构型 拆分成光学活性物质,活性测定表明R2构型的分子更适配于该疏水腔;三卤苯基与Tyr1230发生xx堆 18活性强于RS和S构型,对酶和细胞抑制活性分别积,氟和氯原子还与Asp1222的NH发生静电引力, 为K1=0002molL和ICso=0.008molL。作为比3的SO2形成氢键更有利。而且距离比3的苯基 进一步研发的候选物命名为克里唑替尼( crizotinib)。更有利。母核2-氨基吡啶平面结合于铰链区,而没有 c-Met Ki/umol. L 0.0815 LipE (Ki) 1.38 2.80 cMet细胞ICs/molL C-Met K,/umol L- 0.0702 0.0193 cMet细胞ICs/molL 0.0406 00183 LipE (ICso) HLM(剩余%量

郭宗儒: 基于酶结构设计的个体化治疗药物克里唑替尼 · 675 · 氨基吡啶与吡唑环的连接方式对活性影响很大, 例如化合物 13 和 14 的活性 (酶的 Ki 和细胞的 IC50) 以及 LipE 值相差很大。结构生物学表明, 13 的吡唑 环氮原子所处的位置使得 c-Met 的残基 Met1160 和 Ile1084 取向与吡唑环邻近, 不利于氨基吡啶的氢键 结合, 而且该吡唑环处于酶蛋白的疏水性界面, 为了 发生疏水−疏水相互作用, N 原子的孤电子对的去水 合作用是不利的焓变; 而 14 的 N 原子都进入了水相, 没有上述的不利效应, 因而活性高于 13, 酶或细胞活 性提高了 30～40 倍。化合物 14 的 N-甲基化后产物 15 的活性更强, 提示由这个 N 原子可引出含有极性 基团的碳链, 以提高活性水溶性。 3.5 N-取代的吡唑化合物的优化 鉴于化合物 10 结 构中含有延伸到水相的碱性基团能够提高活性和亲 脂性效率, 因而也在吡咯环系上引入尽可能小的碱 性片段, 例如链烷基叔胺、氮杂环丁烷、四氢吡咯、 哌啶等, 以增加活性和改善药学和药代性质。在选择 高活性 (酶和细胞) 和高亲脂性效率的化合物同时, 还评价对人肝微粒体 (HLM) 的稳定性, 从有代表性 的化合物中优选出 16 和 17, 尤其是因 17 的高活性和 较好的代谢稳定性, 确定为候选药物。 3.6 光学活性的候选药物——克里唑替尼的成功 前 述优化过程制备的吡唑系列化合物含有手性碳原子, 都是用混旋的样品测定活性的。将优选出的化合物 17 拆分成光学活性物质, 活性测定表明 R-构型的分子 18 活性强于 RS 和 S 构型, 对酶和细胞抑制活性分别 为 Ki = 0.002 μmol·L −1 和 IC50 = 0.008 μmol·L −1。作为 进一步研发的候选物命名为克里唑替尼 (crizotinib)。 4 克里唑替尼的作用特征 4.1 克里唑替尼的物化和活性参数 以化合物 5 为 先导化合物成功研制出克里唑替尼 18, 体现了结构 生物学和药物化学结合应用的成果, 表 1 比较了化合 物 5 和 18 的物化和生物学参数。在优化的路径上, 相 对分子质量降低了 191 (30%), 表征亲脂性的分布系 数降低了 1.3 个对数单位 (20 倍), 对 c-Met 细胞的抑 制活性没变, 亲脂性效率增加了 1.3 个对数单位。 表 1 化合物 5 与 18 的物化性质和活性参数的比较 化合物 相对分 子质量 LogD c-Met 细胞/ IC50/nmol·L −1 LE LipE (IC50) 5 641.62 3.20 9 0.25 4.85 18 450.34 1.96 8 0.38 6.14 4.2 克里唑替尼与 c-Met 结合特征 克里唑替尼 (化合物 18) 与 c-Met 的复合物晶体结构表明, 其结 合模式与 3 基本相同。α-甲基苄基与 c-Met 的环套 A 发生相互作用, 不仅有助于苄基的定位, 而且增加了 与疏水腔 (由 Val1092、Leu1157、Lys1110 和 Ala1108 的侧链构成) 发生的疏水相互作用, 甲基处于 R 构型 更适配于该疏水腔; 三卤苯基与 Tyr1230 发生 π-π 堆 积, 氟和氯原子还与 Asp1222 的 N-H 发生静电引力, 比 3 的 SO2 形成氢键更有利。而且距离比 3 的苯基 更有利。母核 2-氨基吡啶平面结合于铰链区, 而没有 13 14 15 c-Met Ki /μmol·L −1 3.19 0.081 5 0.046 LipE (Ki) 1.38 2.41 2.80 c-Met 细胞 IC50 /μmol·L −1 2.64 0.062 4 0.043 8 LipE (IC50) 1.46 2.52 2.83 16 17 c-Met Ki /μmol·L −1 0.070 2 0.019 3 c-Met 细胞 IC50 /μmol·L −1 0.040 6 0.018 3 LipE (IC50) 6.06 5.62 HLM (剩余%量) 71 44.6

676 药学学报 Acta pharmaceutica sinica2016,51(4)672-676 3的羟基吲哚结合时发生构象变化而引起的张力。5- 克里唑替尼与ALK激酶结合域的复合物晶体结 4-吡唑)基结合于由Ilo084和 Tyrol59构成的狭窄构( PDB code2xp2)表明,其结合模式与酮c-Met结 的亲脂性通道内,哌啶环进入水相之中。图3是化合合特征相似,主要的区别在于ALK的环套A没有类 物18与cMet酶复合物的晶体结构图CuiJ,Tran-似于同cMet的Tyr1230发生rx堆积作用,因而活 Dube m, Shen h,eta. Structure based drug design of性低于c-Met激酶;另一个区别是与2-氨基吡啶和3- crizotinib(PF-02341066, a potent and selective dual卤代苄氧基发生疏水相互作用的残基不同,cMet为 inhibitor of mesenchymal-epithelial transition factor MetI21.而ALK为Leu211。虽然化学结构的构建 ( C-MET)kinase and anaplastic lymphoma kinase(ALK是基于cMet酶的结构的,但由于同cMet和ALK结 J Med chem,2011,54:6342-6363) 合的相似性,因而克里唑替尼成为作用于双靶标的 抗肿瘤药物。 5克里唑替尼的批准上市 克里唑替尼是cMet/ALK激酶双靶标抑制剂, 可能成为ALK融合蛋白呈阳性的非小细胞肺癌患 者的潜在靶向药物。因此辉瑞公司在2007年迅速调 整了临床试验的研发方向,转向那些2%~7%含有 NPM-ALK瘤源性融合基因的非小细胞肺癌患者。 根据FDA关于靶向治疗和伴随诊断的指导意见 图3化合物18与cMet酶复合物晶体结构 在临床试验中辉瑞与FDA以及发现ALK融合基因 的雅培公司的分子诊断业务部门进行了密切合作,确 43克里唑替尼对ALK激酶的选择性作用为了保辉瑞的克里唑替尼与雅培的 Vysis AlK Break Apart 证明克里唑替尼的选择性抑制作用,评价了它对人FSH(荧光原位杂交)探针试剂盒同时获得批准。从 的120个激酶抑制活性,发现克里唑替尼对间变性淋20070年立项到2011年克里唑替尼(商品名为 Xalkori) 巴瘤激酶( anaplastic lymphoma kinase,ALK)与核磷批准上市,仅用了4年时间。克里唑替尼的研发是个 蛋白( nucleophosmin,NPM)的融合蛋白高表达细胞体化治疗的又一个重大突破,美国国家癌症综合网 的抑制活性很高(Cs0=20 moll),ALK融合蛋白络(NCCN)推荐作为ALK阳性的晚期非小细胞肺癌 是发生间变性淋巴瘤、炎性肌纤维细胞瘤和非小细胞患者标准药物,其地位甚至超越了常规化疗( Roberts 肺癌的关键性酶,因而预计克里唑替尼可治疗非小PJ. Clinical use of crizotinib for the treatment of non- 细胞肺癌等恶性肿瘤。 small cell lung cancer. Biologics, 2013, 7: 91-101)

· 676 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (4): 672 −676 3 的羟基吲哚结合时发生构象变化而引起的张力。5- (4-吡唑) 基结合于由 Ile1084 和 Tyr1159 构成的狭窄 的亲脂性通道内, 哌啶环进入水相之中。图 3 是化合 物 18 与 c-Met 酶复合物的晶体结构图 (Cui JJ, Tran￾Dubé M, Shen H, et al. Structure based drug design of crizotinib (PF-02341066), a potent and selective dual inhibitor of mesenchymal-epithelial transition factor (c-MET) kinase and anaplastic lymphoma kinase (ALK). J Med Chem, 2011, 54: 6342−6363)。 图 3 化合物 18 与 c-Met 酶复合物晶体结构 4.3 克里唑替尼对 ALK 激酶的选择性作用 为了 证明克里唑替尼的选择性抑制作用, 评价了它对人 的 120 个激酶抑制活性, 发现克里唑替尼对间变性淋 巴瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase, ALK) 与核磷 蛋白 (nucleophosmin, NPM) 的融合蛋白高表达细胞 的抑制活性很高 (IC50=20 nmol·L −1 ), ALK 融合蛋白 是发生间变性淋巴瘤、炎性肌纤维细胞瘤和非小细胞 肺癌的关键性酶, 因而预计克里唑替尼可治疗非小 细胞肺癌等恶性肿瘤。 克里唑替尼与 ALK 激酶结合域的复合物晶体结 构 (PDB code 2xp2) 表明, 其结合模式与酮 c-Met 结 合特征相似, 主要的区别在于 ALK 的环套 A 没有类 似于同 c-Met 的 Tyr1230 发生 π-π 堆积作用, 因而活 性低于 c-Met 激酶; 另一个区别是与 2-氨基吡啶和 3- 卤代苄氧基发生疏水相互作用的残基不同, c-Met 为 Met1211, 而 ALK 为 Leu1211。虽然化学结构的构建 是基于 c-Met 酶的结构的, 但由于同 c-Met 和 ALK 结 合的相似性, 因而克里唑替尼成为作用于双靶标的 抗肿瘤药物。 5 克里唑替尼的批准上市 克里唑替尼是 c-Met/ALK 激酶双靶标抑制剂, 可能成为 ALK 融合蛋白呈阳性的非小细胞肺癌患 者的潜在靶向药物。因此辉瑞公司在 2007 年迅速调 整了临床试验的研发方向, 转向那些 2%～7% 含有 NPM-ALK 瘤源性融合基因的非小细胞肺癌患者。 根据 FDA 关于靶向治疗和伴随诊断的指导意见, 在临床试验中辉瑞与 FDA 以及发现 ALK 融合基因 的雅培公司的分子诊断业务部门进行了密切合作, 确 保辉瑞的克里唑替尼与雅培的 Vysis ALK Break Apart FISH (荧光原位杂交) 探针试剂盒同时获得批准。从 2007 年立项到 2011 年克里唑替尼 (商品名为 Xalkori) 批准上市, 仅用了 4 年时间。克里唑替尼的研发是个 体化治疗的又一个重大突破, 美国国家癌症综合网 络 (NCCN) 推荐作为 ALK 阳性的晚期非小细胞肺癌 患者标准药物, 其地位甚至超越了常规化疗 (Roberts PJ. Clinical use of crizotinib for the treatment of non￾small cell lung cancer. Biologics, 2013, 7: 91–101)