500 药学学报 Acta pharmaceutica sinica2017,52(3):500-504 新药发现与研究实例简析 新药创制是复杂的智力活动,涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效罘等多维科技活动。每个药物 都有自身的研发轨迹,而构建化学结构是最重要的环节,因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。 本栏目以药物化学视角,对有代表性的药物的成功构建,加以剖析和解读 色瑞替尼是首创药物克唑替尼的后续药,作用杋制明确,靶标相同,二者上市相距三年。实际上,色瑞替尼 貌似跟踪,却胜似跟踪,因为它对克唑替尼发生耐药的患者效果显著而有重大突破,具有鲜明的创新性。尽管迄 今尚不完全清楚其抗耐药性的结构基础,发明色瑞替尼包含有幸运的色彩,但诺华的研究者将先导物的结构“精 雕细刻”地优化,为了在酶和细胞水平上提高活性和选择性,消除警戒结构和强化成药性,对遍及骨架周遭的基 团和片段进行了多方位变換和探索,成为运用药物化学理念和构效关系分析的一个成功范例。 (编者按) DO:10.1643800513-4870.20150242 首创性的“跟踪”药物色瑞替尼 郭宗儒 (中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所,北京100050) 1研究背景 有一种肿瘤称作间变性大细胞淋巴瘤(ALCL), 是类罕见的非何杰金T细胞淋巴瘤,多发生在皮肤 O OlIN 骨骼、软组织和多种脏器中,这种全身性肿瘤的发生 原因,大多是发生了t(25)(p23q25)染色体易位,产 生了由间变性淋巴瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase,ALK)与核磷蛋白( nucleophosmin,NPM)胞2活性评价 内结构域的融合基因,高表达的 ALK-NPM蛋白是发 色瑞替尼毕竟是晚于首创药物克唑替尼的第 生间变性淋巴瘤、炎性肌纤维细胞瘤和非小细胞肺癌代药物,但由于起始的先导物的活性很高,起点高, 等关键性酶,因而是研发这类罕见病个性化治疗的因而评价优化的化合物活性在用 ALK-NPM激酶测 关键性靶标。 定的同时,还用高表达 ALK-NPM激酶的Ba/F3细胞 以ALK激酶为靶标首创性的药物是由辉瑞研发评价抑制生长活性(目标是酶和细胞水平的高活性) 的克唑替尼(1a, crizotinib),上市于2011年,治疗非也由于ALK激酶属于胰岛素受体家族的成员,为了 小细胞肺癌。诺华创制的本品色瑞替尼(1b, ceritinib),评价化合物对ALK的特异性抑制,还评价对高表达 上市于2014年,三年的间隔使色瑞替尼沦为后续研 Tel-InsR融合蛋白的Ba/F3细胞的作用(目标是低或 发的药物,然而由于与克唑替尼有相当长时间的研无活性),为了消除细胞毒的非特异性作用,还测定 发重合期,他们的研发路径和结构优化过程以及候了对野生型( WT) Ba/F3细胞的活性(目标是低或无 选化合物的确定,却是独立进行和较少借鉴的,反映活性),还用具有表达 ALK-NPM蛋白、人ALKL肿 在结构上,1a和1b具有不同的结构骨架和药效团的瘤的ALK呈阳性的 Karpas299细胞评价化合物的抗 特征。而且,尽管是作用于同一靶标,但本品的特点增殖活性(目标是高活性)。 是对克唑替尼发生耐药的患者有效,被称为抢救性3先导化合物的发现 抗肿瘤药物。 3.1具有高活性化合物的发现诺华公司为了研发
· 500 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (3): 500 −504 ·新药发现与研究实例简析· 新药创制是复杂的智力活动, 涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物 都有自身的研发轨迹, 而构建化学结构是最重要的环节, 因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。 本栏目以药物化学视角, 对有代表性的药物的成功构建, 加以剖析和解读。 色瑞替尼是首创药物克唑替尼的后续药, 作用机制明确, 靶标相同, 二者上市相距三年。实际上, 色瑞替尼 貌似跟踪, 却胜似跟踪, 因为它对克唑替尼发生耐药的患者效果显著而有重大突破, 具有鲜明的创新性。尽管迄 今尚不完全清楚其抗耐药性的结构基础, 发明色瑞替尼包含有幸运的色彩, 但诺华的研究者将先导物的结构“精 雕细刻”地优化, 为了在酶和细胞水平上提高活性和选择性, 消除警戒结构和强化成药性, 对遍及骨架周遭的基 团和片段进行了多方位变换和探索, 成为运用药物化学理念和构效关系分析的一个成功范例。 (编者按) DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0242 首创性的“跟踪”药物色瑞替尼 郭宗儒 (中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050) 1 研究背景 有一种肿瘤称作间变性大细胞淋巴瘤 (ALCL), 是类罕见的非何杰金 T 细胞淋巴瘤, 多发生在皮肤、 骨骼、软组织和多种脏器中, 这种全身性肿瘤的发生 原因, 大多是发生了 t(2;5) (p23;q25) 染色体易位, 产 生了由间 变 性淋巴 瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase, ALK) 与核磷蛋白 (nucleophosmin, NPM) 胞 内结构域的融合基因, 高表达的 ALK-NPM 蛋白是发 生间变性淋巴瘤、炎性肌纤维细胞瘤和非小细胞肺癌 等关键性酶, 因而是研发这类罕见病个性化治疗的 关键性靶标。 以 ALK 激酶为靶标首创性的药物是由辉瑞研发 的克唑替尼 (1a, crizotinib), 上市于 2011 年, 治疗非 小细胞肺癌。诺华创制的本品色瑞替尼 (1b, ceritinib), 上市于 2014 年, 三年的间隔使色瑞替尼沦为后续研 发的药物, 然而由于与克唑替尼有相当长时间的研 发重合期, 他们的研发路径和结构优化过程以及候 选化合物的确定, 却是独立进行和较少借鉴的, 反映 在结构上, 1a 和 1b 具有不同的结构骨架和药效团的 特征。而且, 尽管是作用于同一靶标, 但本品的特点 是对克唑替尼发生耐药的患者有效, 被称为抢救性 抗肿瘤药物。 2 活性评价 色瑞替尼毕竟是晚于首创药物克唑替尼的第二 代药物, 但由于起始的先导物的活性很高, 起点高, 因而评价优化的化合物活性在用 ALK-NPM 激酶测 定的同时, 还用高表达 ALK-NPM 激酶的 Ba/F3 细胞 评价抑制生长活性 (目标是酶和细胞水平的高活性); 也由于 ALK 激酶属于胰岛素受体家族的成员, 为了 评价化合物对 ALK 的特异性抑制, 还评价对高表达 Tel-InsR 融合蛋白的 Ba/F3 细胞的作用 (目标是低或 无活性); 为了消除细胞毒的非特异性作用, 还测定 了对野生型 (WT) Ba/F3 细胞的活性 (目标是低或无 活性); 还用具有表达 ALK-NPM 蛋白、人 ALKL 肿 瘤的 ALK 呈阳性的 Karpas 299 细胞评价化合物的抗 增殖活性 (目标是高活性)。 3 先导化合物的发现 3.1 具有高活性化合物的发现 诺华公司为了研发
郭宗儒:首创性的“跟踪”药物色瑞替尼 针对ALK-NPM激酶为靶标的抑制剂,用已有针对其 Schindler t, Bornmann v, Pellicena p,etal. Structural 他激酶而合成的小分子化合物库进行了随机筛选, mechanism for STi-57 I inhibition of abelson tyrosine 从中发现了化合物2(代号TAE684)对高表达 ALk- kinase. Science,,2000289:1938-1942)。然而,化合物 NPM的Ba/F3细胞有强抑制活性,ICs0=3 nmol. L-1,2结合于ATP位点却显示有高选择性抑制活性,推测 而对野生型Ba/F3细胞在1pmoL浓度下没有抑制可能是由于在苯胺片段的2位存在甲氧基,该甲氧基 作用,提示该先导物是选择性高的强效抑制剂。图1处于ALK铰链处的Leu258和Me259残基侧链构 是化合物2与ALK激酶分子对接图。 的疏水性沟槽内,而其他激酶的相应氨基酸尺寸都 比较大,位阻效应阻止了化合物2的甲氧基进入。分 子模拟揭示了甲氧基的重要性( Galkin Av, Melnick JS. Kim S. et al. Identification of NVP-TAE684. a potent, selective, and efficacious inhibitor of NPM ALK. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104: 270-275) 4先导化合物的优化 4.1甲氧基的变换分子模拟揭示了苯胺环上的2 甲氧基对于选择性作用的重要性,首先考察其他的 烷氧基对活性的影响。在合成的化合物中,2-异丙氧 基化合物3仍保持高活性和选择性(疏水性沟槽可容 纳异丙氧基),同时还降低了氧化代谢的程度,表明 2-异丙氧基是一个可替换甲氧基的优选基团。 4.2消除警戒结构化合物2对体外ALK激酶、高 表达ALK的细胞以及体内接种 Karpas-299或BaF3 图1化合物2与ALK激酶分子对接图 NPM-ALK-细胞的小鼠都有强效抑制活性,药代动力 学性质也可以,但却不能作为候选药物。这是因为2 32分子模拟一解析先导物的结合方式用分子模在体内发生氧化代谢,产生有反应活性的代谢产物 拟方法研究了化合物2与ALK激酶的结合特征,以2与肝微粒体温孵,LCMS证明有20%原药转化为有 揭示2在ALK活性部位的定位和取向,以及各个基反应活性的亲电性物质,例如可被谷胱甘肽捕获生 团和片段的结合模式,指导新化合物的设计。由于当成加合物(图2)。 时尚未解析ALK激酶的三维结构,故采用同源模建 亲电性物质源于分子中的对苯二胺结构(称作 方法,根据同源性强的已知InsR的三维结构,构建警戒结构, structural alert),对苯二胺有较高的电荷密 了ALK三维结构。分子对接显示,化合物2占据的度,是细胞色素P450的氧化位点,生成带有正电荷 位置是ATP结合腔,结构中2-氨基嘧啶片段通过两的1,4亚胺醌,为强亲电性基团,容易同体内亲核基 个氢键结合固定于ALK的铰链处,2并没有延伸到团发生亲核取代反应,具有产生特质性药物毒性 变构区的疏水腔中。皆知,Abl特异性抑制剂伊马替D)的风险( Orhan h, Vermeulen NPe. Conventional 尼与激酶的结合位点是ATP旁边的变构区的疏水腔, and novel approaches in generating and characterization 与激酶的非活性“DFG-out”构象结合,因而呈现出 of reactive intermediates from drugs/drug candidates 比结合于ATP位点的抑制剂具有更高的选择性活性 Curr Drug metab,20ll,12:383-394) Hc O oHNN NS 对苯二胺被氧化 生成亲电性醌式亚铵离子 与亲核基团生成加合物 图2化合物2氧化产物和与谷胱甘肽(GSH)的加合物
郭宗儒: 首创性的“跟踪”药物色瑞替尼 · 501 · 针对 ALK-NPM 激酶为靶标的抑制剂, 用已有针对其 他激酶而合成的小分子化合物库进行了随机筛选, 从中发现了化合物 2 (代号 TAE684) 对高表达 ALKNPM 的 Ba/F3 细胞有强抑制活性, IC50 = 3 nmol·L −1 , 而对野生型 Ba/F3 细胞在 1 μmol·L −1 浓度下没有抑制 作用, 提示该先导物是选择性高的强效抑制剂。图 1 是化合物 2 与 ALK 激酶分子对接图。 图 1 化合物 2 与 ALK 激酶分子对接图 3.2 分子模拟—解析先导物的结合方式 用分子模 拟方法研究了化合物 2 与 ALK 激酶的结合特征, 以 揭示 2 在 ALK 活性部位的定位和取向, 以及各个基 团和片段的结合模式, 指导新化合物的设计。由于当 时尚未解析 ALK 激酶的三维结构, 故采用同源模建 方法, 根据同源性强的已知 InsR 的三维结构, 构建 了 ALK 三维结构。分子对接显示, 化合物 2 占据的 位置是 ATP 结合腔, 结构中 2-氨基嘧啶片段通过两 个氢键结合固定于 ALK 的铰链处, 2 并没有延伸到 变构区的疏水腔中。皆知, Abl 特异性抑制剂伊马替 尼与激酶的结合位点是 ATP 旁边的变构区的疏水腔, 与激酶的非活性“DFG-out”构象结合, 因而呈现出 比结合于 ATP 位点的抑制剂具有更高的选择性活性 (Schindler T, Bornmann W, Pellicena P, et al. Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine kinase. Science, 2000, 289: 1938−1942)。然而, 化合物 2 结合于 ATP 位点却显示有高选择性抑制活性, 推测 可能是由于在苯胺片段的 2 位存在甲氧基, 该甲氧基 处于 ALK 铰链处的 Leu258 和 Met259 残基侧链构成 的疏水性沟槽内, 而其他激酶的相应氨基酸尺寸都 比较大, 位阻效应阻止了化合物 2 的甲氧基进入。分 子模拟揭示了甲氧基的重要性 (Galkin AV, Melnick JS, Kim SJ, et al. Identification of NVP-TAE684, a potent, selective, and efficacious inhibitor of NPMALK. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104: 270−275)。 4 先导化合物的优化 4.1 甲氧基的变换 分子模拟揭示了苯胺环上的 2- 甲氧基对于选择性作用的重要性, 首先考察其他的 烷氧基对活性的影响。在合成的化合物中, 2-异丙氧 基化合物 3 仍保持高活性和选择性 (疏水性沟槽可容 纳异丙氧基), 同时还降低了氧化代谢的程度, 表明 2-异丙氧基是一个可替换甲氧基的优选基团。 4.2 消除警戒结构 化合物 2 对体外 ALK 激酶、高 表达 ALK 的细胞以及体内接种 Karpas-299-或 Ba/F3 NPM-ALK-细胞的小鼠都有强效抑制活性, 药代动力 学性质也可以, 但却不能作为候选药物。这是因为 2 在体内发生氧化代谢, 产生有反应活性的代谢产物, 2 与肝微粒体温孵, LC-MS 证明有 20%原药转化为有 反应活性的亲电性物质, 例如可被谷胱甘肽捕获生 成加合物 (图 2)。 亲电性物质源于分子中的对苯二胺结构 (称作 警戒结构, structural alert), 对苯二胺有较高的电荷密 度, 是细胞色素 P450 的氧化位点, 生成带有正电荷 的 1,4 亚胺醌, 为强亲电性基团, 容易同体内亲核基 团发生亲核取代反应, 具有产生特质性药物毒性 (ITD) 的风险 (Orhan H, Vermeulen NPE. Conventional and novel approaches in generating and characterization of reactive intermediates from drugs/drug candidates. Curr Drug Metab, 2011, 12: 383−394)。 图 2 化合物 2 氧化产物和与谷胱甘肽 (GSH) 的加合物
502 药学学报 Acta pharmaceutica sinica2017,52(3):500-504 4.3变换哌嗪为哌啶环氧化代谢生成亲电性基团4.4哌啶环N取代基的变换将左端的连接磺酰基 的原因是分子中存在的对苯二胺片段,生成具有正的基团固定为异丙基(变换为甲基、氨基或环丁基的 电荷的亚胺醌式结构易于结合亲核基团,从而恢复化合物不如异丙基,故被优选),右侧苯环上固定为 成稳定的芳香系统,所以是强亲电性基团。氮原子含甲基取代,变换嘧啶环的取代(氯和甲基)和哌啶N 有未偶电子对,电荷密度高于sp3杂化碳原子,因而取代基,合成一系列化合物,有代表性的化合物8~ 容易被氧化成亲电性醌式结构。为此,将通式3的哌12的结构与活性列于表2 嗪环变换成4-哌啶结构,消除了对苯二胺的结构因 从表2的数据可以看出,除化合物10的活性和 素,设计合成了有代表性的化合物4~7。由于2和3选择性较低外,其余化合物都具有较高的活性和选 已有高活性和选择性,不宜对骨架结构大动,因而固择性。哌啶的N取代基的极性或非极性,基团大小的 定26-二苯胺基嘧啶母核不变,将右端的哌嗪环(可变换对活性没有显著影响,提示氮原子和相连的基 能是助溶基团)换成4-哌啶基,并将异丙磺酰基团没有与酶蛋白结合。 (R1)、嘧啶环上的R2和苯环的R3加以变换,有代表5良好成药性的选择 性的化合物3~7结构与活性列于表1中 5.1评价化合物产生亲电性基团的警戒结构安全 表1的数据提示,嘧啶环上的R2为氯原子或甲性是成药性的前提,应摒弃有潜在毒性的化合物。为 基对活性和选择性有相同的影响,苯环上R3为甲基此,评价了上述高活性和选择性化合物发生代谢氧 取代可提高对人癌细胞 Karpas299的活性。 化而产生亲电性基团的化合物,方法是将受试化合 NCH3 表1化合物2~7的活性和选择性 化合物 Ba/F3-NPM-ALK Ba/F3-Tel-InsR Ba/F3-Wr 结构见前 1336 结构见上 319.5 2884 C-Bu Cl C 17.3 510.9 2517 13.1 表2化合物8~12的结构、活性和选择性 CH3 8~12 化合物 Ba/F3-NPM-ALK Ba/F3-Tel-InsR Ba/F3-WT Karpas299 CHCH,OH 326.5 4336 2584 1186 1420 100.3
· 502 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (3): 500 −504 4.3 变换哌嗪为哌啶环 氧化代谢生成亲电性基团 的原因是分子中存在的对苯二胺片段, 生成具有正 电荷的亚胺醌式结构易于结合亲核基团, 从而恢复 成稳定的芳香系统, 所以是强亲电性基团。氮原子含 有未偶电子对, 电荷密度高于 sp 3 杂化碳原子, 因而 容易被氧化成亲电性醌式结构。为此, 将通式 3 的哌 嗪环变换成 4-哌啶结构, 消除了对苯二胺的结构因 素, 设计合成了有代表性的化合物 4～7。由于 2 和 3 已有高活性和选择性, 不宜对骨架结构大动, 因而固 定 2,6-二苯胺基嘧啶母核不变, 将右端的哌嗪环 (可 能是助溶基团) 换成 4-哌啶基, 并将异丙磺酰基 (R1)、嘧啶环上的 R2 和苯环的 R3 加以变换, 有代表 性的化合物 3～7 结构与活性列于表 1 中。 表 1 的数据提示, 嘧啶环上的 R2 为氯原子或甲 基对活性和选择性有相同的影响, 苯环上 R3 为甲基 取代可提高对人癌细胞 Karpas299 的活性。 4.4 哌啶环 N-取代基的变换 将左端的连接磺酰基 的基团固定为异丙基 (变换为甲基、氨基或环丁基的 化合物不如异丙基, 故被优选), 右侧苯环上固定为 甲基取代, 变换嘧啶环的取代 (氯和甲基) 和哌啶 N- 取代基, 合成一系列化合物, 有代表性的化合物 8～ 12 的结构与活性列于表 2。 从表 2 的数据可以看出, 除化合物 10 的活性和 选择性较低外, 其余化合物都具有较高的活性和选 择性。哌啶的 N-取代基的极性或非极性, 基团大小的 变换对活性没有显著影响, 提示氮原子和相连的基 团没有与酶蛋白结合。 5 良好成药性的选择 5.1 评价化合物产生亲电性基团的警戒结构 安全 性是成药性的前提, 应摒弃有潜在毒性的化合物。为 此, 评价了上述高活性和选择性化合物发生代谢氧 化而产生亲电性基团的化合物, 方法是将受试化合 表 1 化合物 2～7 的活性和选择性 IC50/nmol·L −1 化合物 R1 R2 R3 Ba/F3-NPM-ALK Ba/F3-Tel-InsR Ba/F3-WT Karpas299 2 结构见前 3.7 43.7 1 336 2.4 3 结构见上 24.8 414 3 395 22.5 4 i-Pr Cl H 26.0 319.5 2 477 22.8 5 i-Pr Cl CH3 40.6 541.5 2 884 13.1 6 i-Pr CH3 CH3 38.1 197.2 2 460 13.5 7 c-Bu Cl CH3 17.3 510.9 2 517 13.1 表 2 化合物 8～12 的结构、活性和选择性 IC50/nmol·L −1 化合物 R1 R2 Ba/F3-NPM-ALK Ba/F3-Tel-InsR Ba/F3-WT Karpas299 8 Cl C2H5 32.1 344.5 4 120 11.1 9 Cl CH2CH2OH 8.1 326.5 4 336 8.1 10 Cl 258.4 1 186 1 420 100.3 11 CH3 COCH2NMe2 25.8 416 2 737 21.7 12 CH3 CH3 14.6 375.3 4 077 15.6
郭宗儒:首创性的“跟踪”药物色瑞替尼 物与肝微粒体温孵,加入 NADPH、谷胱甘肽(GSH)而对作用靶标EML4ALK和Tel-ALK高表达的 和尿苷-5-二磷酸( UDPGA),反应后,用LCMS检Ba/F3细胞的ICo值分别为22和40.7 nmol.L-,显 测反应液中生成加合物的含量,并换算成受试物的示了对细胞的高选择性。化合物4对小鼠、大鼠、犬 百分含量。表3列出了有代表性化合物的数据,表明和猴的药代动力学试验表明,口服生物利用度F(% 含有对苯二胺结构的化合物2(存在哌嗪片段)有分别为55、60、100、56;静脉注射的清除率CL 209%转化成亲电性物质,与GSH生成加合物,而含有( mL min-mg)分别为27、37、9、13;半衰期ta(h) 吡啶、哌啶的化合物(4、8、10和12)没有发生代为6、9、21和26,提示在不同动物种属之间也有良 谢转化,未见形成与GSH的加合物 好的药代参数。进而对裸鼠移植性间变性大细胞淋巴 瘤(ALCL)和非小细胞肺癌( NSCLC)作治疗性实 表3代表性化合物与GSH生成加合物的百分率 验,证明在可耐受剂量下有显著抑制生长作用。遂进 七合物 捕获GSH%20<1<1<1<1 入临床研究,命名化合物4为色瑞替尼( ceritinib), 经临床研究后,FDA认为对于间变性淋巴瘤激酶 52药代动力学性质的优选对有代表性的高活性(ALK)阳性转移、经克唑替尼治疗无效的 NSCLC肺 化合物进行了药代动力学性质的测定,包括在啮齿癌患者,作为突破性治疗药物,于2014年批准上市 动物和人肝微控体的清除率(aU,对重要的药物代mmm 谢酶CYP3A4的抑制作用(以咪达唑仑为底物)、化 novel potent and selective anaplastic lymphoma kinase 合物的溶解度以及对hERG的抑制作用(采用多非 (ALK) inhibitor 5-chloro-N2-(2-isopropoxy-5-methyl-4- 利特竞争性结合试验)。结果表明,这些化合物对肝( piperidin-4 yl)phenyl))N4(2( isopropylsulfonyD)phenyl 微粒体都有较好的稳定性;对CYP3A4的抑制作用 pyrimidine-2,4 diamine ( ld378) currently in phase 尚可;有不同的水溶解度,发现与碱性氮原子的pKa1 and phase2 clinical trials. J Med Chem,2013,56: 相关;对心肌钾通道hERG的作用变化也较大,这5675-5690)。 也与化合物的pKa相关。对化合物4和12进一步用 诺华研制的色瑞替尼是继辉瑞于2011年上市的 膜片钳方法测定对hRG抑制作用的ICso值,分别为克唑替尼的“第二代”产品,但它不是模仿跟进性 46和20molL-,预示4和12对心脏是安全的。表药物。克唑替尼是个性化治疗罕见病药物的重大突 列出了这些化合物的药代数据 破,而色瑞替尼则是针对发生耐药和不能耐受的患 6候选化合物的确定一色瑞替尼的上市 者,所以具有鲜明的创新性。 综合体外对酶和细胞的活性和选择性、药代、安7色瑞替尼与ALK激酶的分子对接 全性和物化性质,确定了化合物4为候选药物,进 化合物2与ALK激酶复合物的单晶结构于2010 步测定4对其他30多种激酶的的抑制活性,结果显年解析( BoSsi rt, Saccardo MB, Ardini e,etal 示,ICs低于100 moll-的激酶只有3个:IGF-IR Crystal structures of anaplastic lymphoma kinase in InsR和STK22D,Co分别为8、7和23nmoL,由 complex with ATP competitive inhibitors. Biochemistry, 于对ALK激酶的IC3o为2mmoL,选择性范围为2010,49:6813-6825),图3是将色瑞替尼分子对接到 70~230倍。对18种激酶高表达的Ba/F3细胞增殖ALK晶体结构中的示意图,嘧啶的氮原子和氨基与 试验表明化合物4的IC50都高于400 moll的浓度,Met99的氮和氧原子分别形成氢键(图中未显示出 表4代表性化合物的药代动力学性质。括弧内数据是用膜片钳方法测定的ICs0值 化合物 肝微粒体清除CLμ 'min.mg CYP3A4/umol-L pH68缓冲液 溶解度和moL hERG/umol.L 5.3(46 umol-L-) 24.5 144 11(20molL)
郭宗儒: 首创性的“跟踪”药物色瑞替尼 · 503 · 物与肝微粒体温孵, 加入 NADPH、谷胱甘肽 (GSH) 和尿苷-5'-二磷酸 (UDPGA), 反应后, 用 LC-MS 检 测反应液中生成加合物的含量, 并换算成受试物的 百分含量。表 3 列出了有代表性化合物的数据, 表明 含有对苯二胺结构的化合物 2 (存在哌嗪片段) 有 20%转化成亲电性物质, 与 GSH 生成加合物, 而含有 吡啶、哌啶的化合物 (4、8、10 和 12) 没有发生代 谢转化, 未见形成与 GSH 的加合物。 表 3 代表性化合物与 GSH 生成加合物的百分率 化合物 2 4 8 10 12 捕获 GSH/% 20 < 1 < 1 < 1 < 1 5.2 药代动力学性质的优选 对有代表性的高活性 化合物进行了药代动力学性质的测定, 包括在啮齿 动物和人肝微粒体的清除率 (CL), 对重要的药物代 谢酶 CYP3A4 的抑制作用 (以咪达唑仑为底物)、化 合物的溶解度以及对 hERG 的抑制作用 (采用多非 利特竞争性结合试验)。结果表明, 这些化合物对肝 微粒体都有较好的稳定性; 对 CYP3A4 的抑制作用 尚可; 有不同的水溶解度, 发现与碱性氮原子的 pKa 相关; 对心肌钾通道 hERG 的作用变化也较大, 这 也与化合物的 pKa 相关。对化合物 4 和 12 进一步用 膜片钳方法测定对 hERG 抑制作用的 IC50 值, 分别为 46 和 20 μmol·L −1 , 预示 4 和 12 对心脏是安全的。表 4 列出了这些化合物的药代数据。 6 候选化合物的确定—色瑞替尼的上市 综合体外对酶和细胞的活性和选择性、药代、安 全性和物化性质, 确定了化合物 4 为候选药物, 进一 步测定 4 对其他 30 多种激酶的的抑制活性, 结果显 示, IC50 低于 100 nmol·L −1 的激酶只有 3 个: IGF-IR、 Ins-R 和 STK22D, IC50 分别为 8、7 和 23 nmol·L −1 , 由 于对 ALK 激酶的 IC50 为 2 nmol·L −1 , 选择性范围为 70～230 倍。对 18 种激酶高表达的 Ba/F3 细胞增殖 试验表明化合物 4的 IC50都高于 400 nmol·L −1的浓度, 而对作用靶标 EML4-ALK 和 Tel-ALK 高表达的 Ba/F3 细胞的 IC50 值分别为 2.2 和 40.7 nmol·L −1 , 显 示了对细胞的高选择性。化合物 4 对小鼠、大鼠、犬 和猴的药代动力学试验表明, 口服生物利用度 F (%) 分别为 55、60、100、56; 静脉注射的清除率 CL (mL·min−1 ·mg−1 ) 分别为 27、37、9、13; 半衰期 t1/2 (h) 为 6、9、21 和 26, 提示在不同动物种属之间也有良 好的药代参数。进而对裸鼠移植性间变性大细胞淋巴 瘤 (ALCL) 和非小细胞肺癌 (NSCLC) 作治疗性实 验, 证明在可耐受剂量下有显著抑制生长作用。遂进 入临床研究, 命名化合物 4 为色瑞替尼 (ceritinib), 经临床研究后, FDA 认为对于间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 阳性转移、经克唑替尼治疗无效的 NSCLC 肺 癌患者, 作为突破性治疗药物, 于 2014 年批准上市 (Marsilje TH, Pei W, Chen B, et al. Synthesis, structure-activity relationships, and in vivo efficacy of the novel potent and selective anaplastic lymphoma kinase (ALK) inhibitor 5-chloro-N2-(2-isopropoxy-5-methyl-4- (piperidin-4-yl)phenyl)-N4 (2-(isopropylsulfonyl)phenyl) pyrimidine-2,4-diamine (LDK378) currently in phase 1 and phase 2 clinical trials. J Med Chem, 2013, 56: 5675−5690)。 诺华研制的色瑞替尼是继辉瑞于 2011 年上市的 克唑替尼的“第二代”产品, 但它不是模仿跟进性 药物。克唑替尼是个性化治疗罕见病药物的重大突 破, 而色瑞替尼则是针对发生耐药和不能耐受的患 者, 所以具有鲜明的创新性。 7 色瑞替尼与 ALK 激酶的分子对接 化合物 2 与 ALK 激酶复合物的单晶结构于 2010 年解析 (Bossi RT, Saccardo MB, Ardini E, et al. Crystal structures of anaplastic lymphoma kinase in complex with ATP competitive inhibitors. Biochemistry, 2010, 49: 6813−6825), 图 3 是将色瑞替尼分子对接到 ALK 晶体结构中的示意图, 嘧啶的氮原子和氨基与 Met1199 的氮和氧原子分别形成氢键 (图中未显示出 表 4 代表性化合物的药代动力学性质。*括弧内数据是用膜片钳方法测定的 IC50 值 肝微粒体清除 CL/μL·min−1 ·mg −1 化合物 小鼠 大鼠 人 CYP3A4/μmol·L −1 pH 6.8 缓冲液 溶解度/μmol·L −1 hERG /μmol·L −1 4 15 15 15 1.4 4 5.3 (46 μmol·L −1 ) * 5 15 10 19 1.5 24 1.25 9 15 14 15 2.5 36 2.64 11 45 21 46 0.6 4 24.5 12 15 14 8 9.8 144 1.1 (20 μmol·L −1 ) *
504 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica2017,52(3):500-504 氨基与氧形成的氢键,虽然距离很近,但未在同一平 面之故,若在溶液中会因柔性构象能够结合);嘧啶 环夹在Ala1148和Leu256中间,氯原子在疏水腔后 面,与门户氨基酸Leu11%6发生疏水相互作用;与磺 酰基相连的异丙基向下弯入到由Arg1253、Asn1254 Cys1255、Leul256、Gly1260和Asp1270组成的疏 水腔内;异丙氧基则进入由Arg1120和Glu132的侧 链以及铰链的氨基酸残基Leu98Aa1200Gly1201- Gly1202组成的疏水腔 图3色瑞替尼与ALK激酶的分子对接图
· 504 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2017, 52 (3): 500 −504 图 3 色瑞替尼与 ALK 激酶的分子对接图 氨基与氧形成的氢键, 虽然距离很近, 但未在同一平 面之故, 若在溶液中会因柔性构象能够结合); 嘧啶 环夹在 Ala1148 和 Leu1256 中间, 氯原子在疏水腔后 面, 与门户氨基酸 Leu1196 发生疏水相互作用; 与磺 酰基相连的异丙基向下弯入到由 Arg1253、Asn1254、 Cys1255、Leu1256、Gly1260 和 Asp1270 组成的疏 水腔内; 异丙氧基则进入由 Arg1120 和 Glu1132 的侧 链以及铰链的氨基酸残基 Leu1198-Ala1200-Gly1201- Gly1202 组成的疏水腔