显微技术功夫茶5:荧光显微镜实用常识和要点 (一)光路和成像原理概要 荧光显微镜的基本原理是:采用高能量的激发光照射细胞/组织标本,使 标本中的荧光物质发生电子跳跃,从而发出荧光进入目镜视野。 为使荧光图像清晰,需避免激发光进入目镜,故当代荧光显微镜普遍采 用“落/反射”式光路〔在正置镜称落射,在倒置镜称反射),即在物镜与镜筒 接口处插入一个双向棱镜,使横向发来的激发光以90°反折通过物镜射到标 本上:激发出的荧光信号进入物镜聚焦,直线穿越棱镜,再通过阻挡滤镜除 去残余激发光,使单色荧光通过镜筒进入目镜(图7) 所谓激发光,即能起“激发”作用的特定波长(往往波长较短)的光。日 常环境(自然光或灯光)里也含有较弱的激发光成分。 光的波长决定其颜色(图8),不同波长的光可激发不同物质产生不同荧 光。换言之,不同物质适应不同波长的激发光。荧光颜色与激发光颜色有 定互补性,例如,红荧光蛋白(RFP)适应绿激发光;绿荧光蛋白(GFP) 适应蓝激发光;蓝荧光的DAPI适应紫外线。激发光波长都比其所激发的荧 光波长短,波长越短,对活细胞损伤越厉害 在激发光照射过程中,荧光会逐渐衰减乃至淬灭,激发光的波长越短, 荧光衰减的速度越快。这是决定荧光图像优劣的关键因素。标本被照射的时 间越久,实时发出的荧光越弱,图像质量降低,摄影所需曝光时间越长。这 些现象,是在荧光观察,尤其是分组实验标本摄影时务必充分严格掌控的。 否则,所获得的图像数据将严重失真! (二)观察与拍照要点 1.观察前准备:(1)荧光标本制好后(条件许可时应加防荧光猝灭剂封 片),要避光保存以免环境光使荧光衰减:(2)尽量减弱房间内光(关窗 帘和强照明灯);(3)预先检査校正荧光显微镜(校正方法因机型而异, 详见说明书或请售后师傅指导),确认处于良好状态,再从避光处将标本移 入显微镜载物台。 2.观察和拍照:在较弱透射光下调好视野和焦距后,关闭透射光,推出 激发光遮光板,检查荧光信号并再次调焦(荧光成像的焦距可能和透射光不显微技术功夫茶 5：荧光显微镜实用常识和要点 （一）光路和成像原理概要 荧光显微镜的基本原理是：采用高能量的激发光照射细胞/组织标本，使 标本中的荧光物质发生电子跳跃，从而发出荧光进入目镜视野。 为使荧光图像清晰，需避免激发光进入目镜，故当代荧光显微镜普遍采 用“落/反射”式光路（在正置镜称落射，在倒置镜称反射），即在物镜与镜筒 接口处插入一个双向棱镜，使横向发来的激发光以 90°反折通过物镜射到标 本上；激发出的荧光信号进入物镜聚焦，直线穿越棱镜，再通过阻挡滤镜除 去残余激发光，使单色荧光通过镜筒进入目镜（图 7）。 所谓激发光，即能起“激发”作用的特定波长（往往波长较短）的光。日 常环境（自然光或灯光）里也含有较弱的激发光成分。 光的波长决定其颜色（图 8），不同波长的光可激发不同物质产生不同荧 光。换言之，不同物质适应不同波长的激发光。荧光颜色与激发光颜色有一 定互补性，例如，红荧光蛋白（RFP）适应绿激发光；绿荧光蛋白（GFP） 适应蓝激发光；蓝荧光的 DAPI 适应紫外线。激发光波长都比其所激发的荧 光波长短，波长越短，对活细胞损伤越厉害。 在激发光照射过程中，荧光会逐渐衰减乃至淬灭，激发光的波长越短， 荧光衰减的速度越快。这是决定荧光图像优劣的关键因素。标本被照射的时 间越久，实时发出的荧光越弱，图像质量降低，摄影所需曝光时间越长。这 些现象，是在荧光观察，尤其是分组实验标本摄影时务必充分严格掌控的。 否则，所获得的图像数据将严重失真！ （二）观察与拍照要点 1. 观察前准备：（1）荧光标本制好后（条件许可时应加防荧光猝灭剂封 片），要避光保存以免环境光使荧光衰减；（2）尽量减弱房间内光（关窗 帘和强照明灯）；（3）预先检查校正荧光显微镜（校正方法因机型而异， 详见说明书或请售后师傅指导），确认处于良好状态，再从避光处将标本移 入显微镜载物台。 2. 观察和拍照：在较弱透射光下调好视野和焦距后，关闭透射光，推出 激发光遮光板，检查荧光信号并再次调焦（荧光成像的焦距可能和透射光不