显微技术功夫茶5:荧光显微镜实用常识和要点 (一)光路和成像原理概要 荧光显微镜的基本原理是:采用高能量的激发光照射细胞/组织标本,使 标本中的荧光物质发生电子跳跃,从而发出荧光进入目镜视野。 为使荧光图像清晰,需避免激发光进入目镜,故当代荧光显微镜普遍采 用“落/反射”式光路〔在正置镜称落射,在倒置镜称反射),即在物镜与镜筒 接口处插入一个双向棱镜,使横向发来的激发光以90°反折通过物镜射到标 本上:激发出的荧光信号进入物镜聚焦,直线穿越棱镜,再通过阻挡滤镜除 去残余激发光,使单色荧光通过镜筒进入目镜(图7) 所谓激发光,即能起“激发”作用的特定波长(往往波长较短)的光。日 常环境(自然光或灯光)里也含有较弱的激发光成分。 光的波长决定其颜色(图8),不同波长的光可激发不同物质产生不同荧 光。换言之,不同物质适应不同波长的激发光。荧光颜色与激发光颜色有 定互补性,例如,红荧光蛋白(RFP)适应绿激发光;绿荧光蛋白(GFP) 适应蓝激发光;蓝荧光的DAPI适应紫外线。激发光波长都比其所激发的荧 光波长短,波长越短,对活细胞损伤越厉害 在激发光照射过程中,荧光会逐渐衰减乃至淬灭,激发光的波长越短, 荧光衰减的速度越快。这是决定荧光图像优劣的关键因素。标本被照射的时 间越久,实时发出的荧光越弱,图像质量降低,摄影所需曝光时间越长。这 些现象,是在荧光观察,尤其是分组实验标本摄影时务必充分严格掌控的。 否则,所获得的图像数据将严重失真! (二)观察与拍照要点 1.观察前准备:(1)荧光标本制好后(条件许可时应加防荧光猝灭剂封 片),要避光保存以免环境光使荧光衰减:(2)尽量减弱房间内光(关窗 帘和强照明灯);(3)预先检査校正荧光显微镜(校正方法因机型而异, 详见说明书或请售后师傅指导),确认处于良好状态,再从避光处将标本移 入显微镜载物台。 2.观察和拍照:在较弱透射光下调好视野和焦距后,关闭透射光,推出 激发光遮光板,检查荧光信号并再次调焦(荧光成像的焦距可能和透射光不
显微技术功夫茶 5：荧光显微镜实用常识和要点 （一）光路和成像原理概要 荧光显微镜的基本原理是：采用高能量的激发光照射细胞/组织标本，使 标本中的荧光物质发生电子跳跃，从而发出荧光进入目镜视野。 为使荧光图像清晰，需避免激发光进入目镜，故当代荧光显微镜普遍采 用“落/反射”式光路（在正置镜称落射，在倒置镜称反射），即在物镜与镜筒 接口处插入一个双向棱镜，使横向发来的激发光以 90°反折通过物镜射到标 本上；激发出的荧光信号进入物镜聚焦，直线穿越棱镜，再通过阻挡滤镜除 去残余激发光，使单色荧光通过镜筒进入目镜（图 7）。 所谓激发光，即能起“激发”作用的特定波长（往往波长较短）的光。日 常环境（自然光或灯光）里也含有较弱的激发光成分。 光的波长决定其颜色（图 8），不同波长的光可激发不同物质产生不同荧 光。换言之，不同物质适应不同波长的激发光。荧光颜色与激发光颜色有一 定互补性，例如，红荧光蛋白（RFP）适应绿激发光；绿荧光蛋白（GFP） 适应蓝激发光；蓝荧光的 DAPI 适应紫外线。激发光波长都比其所激发的荧 光波长短，波长越短，对活细胞损伤越厉害。 在激发光照射过程中，荧光会逐渐衰减乃至淬灭，激发光的波长越短， 荧光衰减的速度越快。这是决定荧光图像优劣的关键因素。标本被照射的时 间越久，实时发出的荧光越弱，图像质量降低，摄影所需曝光时间越长。这 些现象，是在荧光观察，尤其是分组实验标本摄影时务必充分严格掌控的。 否则，所获得的图像数据将严重失真！ （二）观察与拍照要点 1. 观察前准备：（1）荧光标本制好后（条件许可时应加防荧光猝灭剂封 片），要避光保存以免环境光使荧光衰减；（2）尽量减弱房间内光（关窗 帘和强照明灯）；（3）预先检查校正荧光显微镜（校正方法因机型而异， 详见说明书或请售后师傅指导），确认处于良好状态，再从避光处将标本移 入显微镜载物台。 2. 观察和拍照：在较弱透射光下调好视野和焦距后，关闭透射光，推出 激发光遮光板，检查荧光信号并再次调焦（荧光成像的焦距可能和透射光不
致),即可开始观察,观察内容(定性、定位、定量等)视实验目标而 定。若需拍照并做光度测量,应在第一视野调好焦距后暂时推入激发光遮光 板,调节目镜分光板,使光100%进入摄影光路,打开数码摄影系统并设定 相关参数(视软件而定),其中最重要的是曝光参数,务必选定“自动曝光 点测光”(无软件差别)。软件准备好后打开激发光遮光板,在目镜监控下移 动载物台,选择距第一视野约两个视野的新视野,在摄影系统的预览窗口中 重新调焦,点击“黑平衡”后迅速点击摄影按钮。这样做可以避免视野被激发 光照射过久,导致荧光衰减而使拍摄到的荧光强度失真。 3.实验分组摄影:选择预知有荧光信号的标本(若有阳性对照组,通常 选之),按照上述摄影要求进行“自动曝光-点测光”,通过预览窗口选择荧光 图像清晰且背景接近全黑的曝光状态,记录此时软件显示的曝光时间:转换 为“手动曝光”,按刚才测定的曝光时间数值设定曝光时间,移到相距约两个 视野的新视野进行拍照(不做黑平衡):以后各组的拍照统一按此相同的曝 光时间摄影,才能保障各组的荧光强度差别,是真正的实验组间差别,而非 显微摄影的操作误差。 (三)开关机和机时要求 为了获得高能激发光,荧光显微镜用超高压汞灯或超高压金属短弧灯做光 源,灯管内电极在高电压下放电并蒸发金属蒸汽而发强光,灯管内蒸气压达 到≥10大气压。这种特殊状态对使用有特殊要求:(1)开机后2-5min才能 达预期亮度:(2)15min内灯管金属蒸发不均匀,若此时停电将导致金属蒸 汽凝结管壁而使再次开机时可能爆管,因此开机后15mi内严禁关机 (3)两次开机间隔不能小于5分钟,否则灯不亮且会降低灯管寿命;(4) 每次开机必损耗2h寿命,超过(哪怕只超lmin)就再减2h(计4h),依此 类推。所以一定要及时关机。以汞灯计,当前灯管优惠价￥2500(寿命 200h),每次开机将花费“￥12.5×n2”。而且,买一个进口灯管运输和报关需 时≥3月。故务必严格遵循上述(红字)要求,以免无谓的耽误和损失 附图
一致），即可开始观察，观察内容（定性、定位、定量等）视实验目标而 定。若需拍照并做光度测量，应在第一视野调好焦距后暂时推入激发光遮光 板，调节目镜分光板，使光 100% 进入摄影光路，打开数码摄影系统并设定 相关参数（视软件而定），其中最重要的是曝光参数，务必选定“自动曝光- 点测光”（无软件差别）。软件准备好后打开激发光遮光板，在目镜监控下移 动载物台，选择距第一视野约两个视野的新视野，在摄影系统的预览窗口中 重新调焦，点击“黑平衡”后迅速点击摄影按钮。这样做可以避免视野被激发 光照射过久，导致荧光衰减而使拍摄到的荧光强度失真。 3. 实验分组摄影：选择预知有荧光信号的标本（若有阳性对照组，通常 选之），按照上述摄影要求进行“自动曝光-点测光”，通过预览窗口选择荧光 图像清晰且背景接近全黑的曝光状态，记录此时软件显示的曝光时间；转换 为“手动曝光”，按刚才测定的曝光时间数值设定曝光时间，移到相距约两个 视野的新视野进行拍照（不做黑平衡）；以后各组的拍照统一按此相同的曝 光时间摄影，才能保障各组的荧光强度差别，是真正的实验组间差别，而非 显微摄影的操作误差。 （三）开关机和机时要求 为了获得高能激发光，荧光显微镜用超高压汞灯或超高压金属短弧灯做光 源，灯管内电极在高电压下放电并蒸发金属蒸汽而发强光，灯管内蒸气压达 到≥10 大气压。这种特殊状态对使用有特殊要求：（1）开机后 2-5min 才能 达预期亮度；（2）15min 内灯管金属蒸发不均匀，若此时停电将导致金属蒸 汽凝结管壁而使再次开机时可能爆管，因此开机后 15min 内严禁关机； （3）两次开机间隔不能小于 5 分钟，否则灯不亮且会降低灯管寿命；（4） 每次开机必损耗 2h 寿命，超过（哪怕只超 1min）就再减 2h（计 4h），依此 类推。所以一定要及时关机。以汞灯计，当前灯管优惠价￥2500（寿命 200h），每次开机将花费“￥12.5×n2”。而且，买一个进口灯管运输和报关需 时≥3 月。故务必严格遵循上述（红字）要求，以免无谓的耽误和损失。 附图：
阻挡滤镜 绿色荧光 Barrier Filte 激发滤镜 Exciting Fl/ter 双向棱镜 Dichroic Mirror 蓝色激发光 综合色光源 物镜 Objective 标本 Specimen 图7.荧光激发原理 20nm 30nm onM 60nm 7(Onm 图8.光波与颜色 (200-700mm)地 文章作者:江一平,教授,福建医科大学、厦门大学医学院生殖调控 与生殖健康福建省高校重点实验室
文章作者：江一平，教授，福建医科大学、厦门大学医学院生殖调控 与生殖健康福建省高校重点实验室