安徽农业科学, Joumal of A nhui a gri. Sci.2007,35(5):1312,1326 责任编辑朱卯芬责任校对左佳 原生质体融合技术的应用 朱河水,刘记强,杨国宇*,仝千秋,张代(河南农业大学牧医工程学院,河南郑州4500 摘要对原生质体融合技术在农业中的作用进行了综述,介绍了目前原生质体融合技术在微生物、植物遗传育种中的应用情况 关键词原生质体;融合;微生物;植物 中图分类号Q813.2文献标识码A文章编号057-6612007)05-01312-01 A pplication ofP rotop last Fusion T echnobg ZHU He-shuietal College ofA n im alH usbandry and V eterinary, H enan a gricultural U niversity, Zhengzhou, H enan 450002 Abstract O peration of protop ast fusion technobgy in agriculture was reviewed in this paper. The app lication of potop last fusion technobgy to heredity and breed ing in m icrobe and plantwas also elaborated. K ey words Protop last; Fusion: M icrobe: Plant 原生质体融合技术起源于20世纪60年代,是基因重行原生质体融合,构建了多功能工程菌,对黄瓜枯萎病菌具 组技术的一部分。它通过一定的理化条件处理,使外源目的有拮抗作用,对小菜蛾的校正杀虫效率在59%以上,并具 基因进入受体细胞,并得以表达,以期使得受体细胞在原有有内生定殖能力B 性状的基础上,获得所需的新的特殊性状 3在防治动物疾病方面的应用丁伯良等在0MP分型 1原生质融合技术在微生物育种上的应用 和0抗原分型的基础上,进行鸡大肠杆菌原生质体融合研 原生质体融合技术可以在种间、属间及科之间构建出究,构建了具双亲本耐药性、OMP抗原性和0抗原性的鸡大 新型菌株,同时也是菌种改良的重要手段之一。微生物 肠杆菌异型外膜蛋白融合菌株,为研制新型鸡大肠杆菌双 生质体融合技术包括:原生质体的制备、原生质体融合、原价菌苗奠定了基础0 主质体再生 14在乳业发酵剂方面的应用张莉滟等采用 M mutanolysin 1.1在构建啤酒酵母原生质体融合株上的应用融合株法分别制备双歧杆菌和保加利亚乳杆菌的原生质体。通过 的酵母絮凝性好,絮凝颗粒在较短时间沉淀分层,有利于与电场诱导双歧杆菌原生质体与热灭活的保加利亚乳杆菌原 发酵液的分离,大大简化后处理工艺;发酵度高,可以发酵生质体融合,在双层再生培养基上筛选融合株,成功地构建 麦芽三糖,甚至发酵麦芽四糖,异麦芽糖,能较充分地利用出较为稳定的融合株,提高了双歧杆菌的耐性,使其在有关 麦汁中的碳水化合物原生质体融合技术还可以构建葡萄制剂中存活时间延长 酒酒酵母,调节葡萄酒的酸度,增香,促进果胶分解,增强葡2原生质体融合技术在植物育种中的应用 萄酒的抗氧化作用。利用电场诱导原生质体融合技术对产 植物原生质体培养和原生质体融合不仅是植物遗传改 酒率高的菌株和产酒率低但耐高温的菌株进行融合,可得良的重要手段之一,而且原生质体也是研究植物细胞壁再 到耐高温的酵母,以解决在纤维素类物质同步发酵过程中生、细胞分裂和分化等一系列细胞遗传和生理过程的良好 酵母发酵温度同纤维素酶酶解温度不一致的问题臥庞小燕试验材料。应用原生质体融合技术获得体细胞杂种,可以克 等以酒精酵母和热带假丝酵母为亲本,通过单亲灭活原生服其种间杂交不育的缺点,也可以将野生植物中的核控制和 质体融合技术,获得了既具有糖化酶活性又能高产酒精的胞质控制的优良品质、农艺性状及抗性基因转入栽培种中 稳定的酵母融合株即。 Daln(1988从悬浮培养高羊茅和多年生黑麦草中获 王菲等以黄色短杆菌WⅥ10和ASL495为亲本菌株,探得了再生植株吲。 Inokkum a1996在暖季型草坪草的原生质 讨了其原生质体形成和再生的条件,并在此基础上进行了体培养中,以根尖顶端分生组织为外植体,建立了日本结缕 原生质体融合试验,筛选出目的融合子,产酸量没有明显提草的原生质体植株再生体系。金红等利用原生质体技术 高,但副产氨基酸主要是亮氨酸)减少,因此,对工业生产得到豆科牧草沙打旺+紫花苜蓿的属间体细胞杂种 中分离提纯工作和筛选高产菌具有指导意义的潘延云等利 胡琼等利用原生质体融合技,获得了甘蓝型油菜品 原生质体融合技术,可使碱性蛋白酶生产菌2709与枯草中双4号与新疆野生油菜野油18的对称性体细胞杂种 杆菌BD105杂交,得到1株高产碱性蛋白酶的工程菌A16。在茄子育种研究中,连勇等应用原生质体融合技术,获得了 A16的表型与生长特征与2709相似,相同条件下发酵酶活茄子种间的体细胞杂种,为茄子抗病育种提供新材0。司家 性比2709菌株高50%,摇瓶发酵的产酶水平最高可达钢等用紫外线辐射处理胡萝卜雄蕊瓣化型不育材料的原生 30000u加1。原位杂交鉴定结果表明,该菌株携有双亲的遗质体,与经15mmoM碘乙酰胺预处理原生质依受体)电融 传物质 合,获得了33株再生植株。虞秋成对野生优质工业用油 1.2在防治蔬菜害虫方面的应用颜念龙等利用苏云金植物 Fend eri的原生质体进行培养,同时利用其原生质体 芽孢杆菌和具有内生及防病等优良特性的桔草芽孢杆菌进与普通栽培油菜品种原生质体融合。发现低剂量γ射线辐 照处理更有利于促进原生质体融合;子叶原生质体间细胞 作者简介朱河水1975-),男,河南郑州人,讲师,从事动物生理生化融合频率高于下胚轴原生质体间细胞融合频率;原生质体 研究。*通讯作者 收稿日期2006-11-20 (下转第1326页) e1994-2008chinaAcademicJournalElectronicpuBlishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net作者简介 朱河水( 1975-) , 男, 河南郑州人, 讲师, 从事动物生理生化 研究。* 通讯作者。 收稿日期 2006! 11! 20 原生质体融合技术起源于 20 世纪 60 年代, 是基因重 组技术的一部分。它通过一定的理化条件处理, 使外源目的 基因进入受体细胞, 并得以表达, 以期使得受体细胞在原有 性状的基础上, 获得所需的新的特殊性状[1] 。 1 原生质融合技术在微生物育种上的应用 原生质体融合技术可以在种间、属间及科之间构建出 新型菌株, 同时也是菌种改良的重要手段之一[2] 。微生物原 生质体融合技术包括 : 原生质体的制备、原生质体融合、原 生质体再生[3] 。 1.1 在构建啤酒酵母原生质体融合株上的应用 融合株 的酵母絮凝性好, 絮凝颗粒在较短时间沉淀分层, 有利于与 发酵液的分离, 大大简化后处理工艺; 发酵度高, 可以发酵 麦芽三糖, 甚至发酵麦芽四糖, 异麦芽糖, 能较充分地利用 麦汁中的碳水化合物[4] 。原生质体融合技术还可以构建葡萄 酒酒酵母, 调节葡萄酒的酸度, 增香, 促进果胶分解, 增强葡 萄酒的抗氧化作用。利用电场诱导原生质体融合技术对产 酒率高的菌株和产酒率低但耐高温的菌株进行融合, 可得 到耐高温的酵母, 以解决在纤维素类物质同步发酵过程中 酵母发酵温度同纤维素酶酶解温度不一致的问题[5] 。庞小燕 等以酒精酵母和热带假丝酵母为亲本, 通过单亲灭活原生 质体融合技术, 获得了既具有糖化酶活性又能高产酒精的 稳定的酵母融合株 [6] 。 王菲等以黄色短杆菌 WY10 和 ASL495 为亲本菌株, 探 讨了其原生质体形成和再生的条件, 并在此基础上进行了 原生质体融合试验, 筛选出目的融合子, 产酸量没有明显提 高, 但副产氨基酸( 主要是亮氨酸) 减少, 因此, 对工业生产 中分离提纯工作和筛选高产菌具有指导意义[7] 。潘延云等利 用原生质体融合技术, 可使碱性蛋白酶生产菌 2709 与枯草 杆菌 BD105 杂交, 得到 1 株高产碱性蛋白酶的工程菌 A16。 A16 的表型与生长特征与 2709 相似, 相同条件下发酵酶活 性比 2709 菌株高 50 %, 摇瓶发酵的产酶水平最高可达 30 000 u/ml。原位杂交鉴定结果表明, 该菌株携有双亲的遗 传物质[8] 。 1.2 在防治蔬菜害虫方面的应用 颜念龙等利用苏云金 芽孢杆菌和具有内生及防病等优良特性的枯草芽孢杆菌进 行原生质体融合, 构建了多功能工程菌, 对黄瓜枯萎病菌具 有拮抗作用, 对小菜蛾的校正杀虫效率在 59 %以上, 并具 有内生定殖能力[9] 。 1.3 在防治动物疾病方面的应用 丁伯良等在 OMP 分型 和 O 抗原分型的基础上, 进行鸡大肠杆菌原生质体融合研 究, 构建了具双亲本耐药性、0MP 抗原性和 0 抗原性的鸡大 肠杆菌异型外膜蛋白融合菌株, 为研制新型鸡大肠杆菌双 价菌苗奠定了基础[10] 。 1.4 在乳业发酵剂方面的应用 张莉滟等采用Mutanolysin 法分别制备双歧杆菌和保加利亚乳杆菌的原生质体。通过 电场诱导双歧杆菌原生质体与热灭活的保加利亚乳杆菌原 生质体融合, 在双层再生培养基上筛选融合株, 成功地构建 出较为稳定的融合株, 提高了双歧杆菌的耐性, 使其在有关 制剂中存活时间延长[11] 。 2 原生质体融合技术在植物育种中的应用 植物原生质体培养和原生质体融合不仅是植物遗传改 良的重要手段之一, 而且原生质体也是研究植物细胞壁再 生、细胞分裂和分化等一系列细胞遗传和生理过程的良好 试验材料。应用原生质体融合技术获得体细胞杂种, 可以克 服其种间杂交不育的缺点, 也可以将野生植物中的核控制和 胞质控制的优良品质、农艺性状及抗性基因转入栽培种中。 Dalton( 1988) 从悬浮培养高羊茅和多年生黑麦草中获 得了再生植株[13] 。Inokkuma( 1996) 在暖季型草坪草的原生质 体培养中, 以根尖顶端分生组织为外植体, 建立了日本结缕 草的原生质体植株再生体系[14] 。金红等利用原生质体技术 得到豆科牧草沙打旺 + 紫花苜蓿的属间体细胞杂种[15] 。 胡琼等利用原生质体融合技, 获得了甘蓝型油菜品种 中双 4 号与新疆野生油菜野油 18 的对称性体细胞杂种[16] 。 在茄子育种研究中, 连勇等应用原生质体融合技术, 获得了 茄子种间的体细胞杂种, 为茄子抗病育种提供新材 [17] 。司家 钢等用紫外线辐射处理胡萝卜雄蕊瓣化型不育材料的原生 质体, 与经 15mmol/L 碘乙酰胺预处理原生质体( 受体) 电融 合, 获得了 33 株再生植株 [18] 。虞秋成对野生优质工业用油 植物 Lfendleri 的原生质体进行培养, 同时利用其原生质体 与普通栽培油菜品种原生质体融合。发现低剂量 γ射线辐 照处理更有利于促进原生质体融合; 子叶原生质体间细胞 融合频率高于下胚轴原生质体间细胞融合频率; 原生质体 ( 下转第 1326 页) 原生质体融合技术的应用 朱河水, 刘记强, 杨国宇 * , 仝千秋, 张 代 ( 河南农业大学牧医工程学院, 河南郑州 450002) 摘要 对原生质体融合技术在农业中的作用进行了综述, 介绍了目前原生质体融合技术在微生物、植物遗传育种中的应用情况。 关键词 原生质体; 融合; 微生物; 植物 中图分类号 Q813.2 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2007) 05- 01312- 01 Application of Protoplast Fusion Technology ZHU He!shui et al (College of Animal Husbandry and Veterinary, Henan Agricultural University, Zhengzhou , Henan 450002) Abstract Operation of protoplast fusion technology in agriculture was reviewed in this paper. The application of protoplast fusion technology to heredity and breeding in microbe and plant was also elaborated. Key words Protoplast; Fusion; Microbe; Plant 安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2007, 35( 5) : 1312, 1326 责任编辑 朱卯芬 责任校对 左 佳