实验2RAPD分析的原理及操作技术 1目的 分子标记是一类建立在分子水平上的遗传标记，它同样具有遗传标记的两个特点， 即可遗传性和可识别性。广义的分子标记包括同工酶和DNA分子标记两类，狭义的分 子标记则仅指后者。DNA分子标记通常是一些小分子量的DNA片段（几十到2O0Obp), 大量存在于真核生物的基因组内，能够通过特定的技术和方法进行检测。一般而言，分 子标记并不是基因，也不是基因的一个部分，但它往往与目的基因（目的性状）有连锁 关系。利用这种连锁关系（越紧密越好），可以对目的基因进行识别和分离，对目的性 状进行早期预选，对优良基因进行聚合育种，从而大大促进园艺植物的育种工作。DNA 分子标记的种类很多，常用的有RAPD(随机扩增多态性DNA)、RFLP(限制性片段长 度多态性)、AFLP(扩增片段长度多态性)、SSR(简单序列重复)等，本实验主要介绍 RAPD分析的实验方法，以了解园艺植物分子标记的基本原理，认识和掌握RAPD分析 在园艺育种中的应用及实验操作技术。 2原理 虽然DNA的基本单元是一个个的单核苷酸，但在只有模板和单核苷酸(NTP)的 反应体系中，DNA聚合酶(Tg酶)并不能启动扩增反应，这是因为该酶催化的反应是 一种延伸反应（在已有的DNA链的3'-OH端掺入单核苷酸，形成磷酸二酯键，合成方 向为5'一3)，因此，还需要在反应体系中提供特定的DNA短链（称为引物），用以启 动DNA的聚合反应。 常规的PCR扩增过程为：①将反应体系（模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4 种dNTP和Tag DNA聚合酶，引物1和2都是特异合成的长度为15一30核苷酸的单链 DNA)置于高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链；②在低温(40 一60℃)下退火，使引物与模板链3端互补区结合形成部分双链DNA:③在中温(72℃》 下延伸，Tag DNA聚合酶根据模板的核苷酸顺序，将单核苷酸从引物的3'端顺次掺入， 催化磷酸二酯键生成，实现新链的延伸。如此变性、退火、延伸，三步构成的一个循环， 可使两种引物限定范围内的DNA序列扩增一倍。由于每次循环的产物都能成为下一循 环的模板，因而PC产物量以指数方式增加，从理论上计算，经过20个循环，目的 77 实验 2 RAPD 分析的原理及操作技术 1 目的 分子标记是一类建立在分子水平上的遗传标记，它同样具有遗传标记的两个特点， 即可遗传性和可识别性。广义的分子标记包括同工酶和 DNA 分子标记两类，狭义的分 子标记则仅指后者。DNA 分子标记通常是一些小分子量的 DNA 片段（几十到 2000bp）， 大量存在于真核生物的基因组内，能够通过特定的技术和方法进行检测。一般而言，分 子标记并不是基因，也不是基因的一个部分，但它往往与目的基因（目的性状）有连锁 关系。利用这种连锁关系（越紧密越好），可以对目的基因进行识别和分离，对目的性 状进行早期预选，对优良基因进行聚合育种，从而大大促进园艺植物的育种工作。DNA 分子标记的种类很多，常用的有 RAPD（随机扩增多态性 DNA）、RFLP（限制性片段长 度多态性）、AFLP（扩增片段长度多态性）、SSR（简单序列重复）等，本实验主要介绍 RAPD 分析的实验方法，以了解园艺植物分子标记的基本原理，认识和掌握 RAPD 分析 在园艺育种中的应用及实验操作技术。 2 原理 虽然 DNA 的基本单元是一个个的单核苷酸，但在只有模板和单核苷酸（dNTP）的 反应体系中，DNA 聚合酶（Taq 酶）并不能启动扩增反应，这是因为该酶催化的反应是 一种延伸反应（在已有的 DNA 链的 3’-OH 端掺入单核苷酸，形成磷酸二酯键，合成方 向为 5’→3’），因此，还需要在反应体系中提供特定的 DNA 短链（称为引物），用以启 动 DNA 的聚合反应。 常规的 PCR 扩增过程为：① 将反应体系（模板 DNA、引物 1、引物 2、Mg2+、4 种 dNTP 和 Taq DNA 聚合酶，引物 1 和 2 都是特异合成的长度为 15－30 核苷酸的单链 DNA）置于高温（94℃）下变性，使模板双链 DNA 解链为两条单链；② 在低温（40 －60℃）下退火，使引物与模板链 3’端互补区结合形成部分双链 DNA；③ 在中温（72℃） 下延伸，Taq DNA 聚合酶根据模板的核苷酸顺序，将单核苷酸从引物的 3’端顺次掺入， 催化磷酸二酯键生成，实现新链的延伸。如此变性、退火、延伸，三步构成的一个循环， 可使两种引物限定范围内的 DNA 序列扩增一倍。由于每次循环的产物都能成为下一循 环的模板，因而 PCR 产物量以指数方式增加，从理论上计算，经过 20 个循环，目的