5'-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3' 2.试剂(实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理) 生理盐水、细胞裂解液(50 mmol tris-HCl,pH8.0; I mmol na2EDTA,pH 80:05%SDS;0.1 mmol naCl)、10mg/ml蛋白酶K、20%SDS、水饱和酚(1mo Tris-HCl抽提)、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿:异戊醇(24:1)、8mol 醋酸钾、无水乙醇、0%乙醇、TE(pH80)(l0 mmolL Tris-HC,pH8.0;0.1 mmol/L Na2EDtA,pH80)、10× buffer( 500mmol/L KCl、100 mmol/L TrisHCl,pH8.3, 室温15 mmol/L MgCh2;0.1%明胶)、4×dNTP(1 mmol/LdAP,1mmo/ L dcTP 1 mmol/l dGTP,1 mmol/l dTTP)、Taq酶(lU/μl1)、引物溶液(l0 pmol/ul)、5×TBE 缓冲液(1000ml)(54 g Tris碱,27.5g硼酸,20ml0.5 MOIL EDTA,pH8.0)、DNA 分子量标记、2%琼脂糖凝胶、载样缓冲液(l0oσm〕(0.2%溴酚蓝,50%蔗糖, l0 mol/l Naoh1~2滴)、10mgml溴化乙锭溶液(戴手套谨慎称取溴化乙锭约 200mg,放入棕色瓶中,加重蒸水20m,溶解后置4℃冰箱保存备用。使用时100n 琼脂糖凝胶中加5μll0mg/ml溴化乙锭溶液,终浓度为0.5ugml)。 3.实验仪器PCR扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳 槽、紫外检测仪。 (三)实验步骤 1.DNA模板制备 方法I:取毛发1~2根,尽量剪碎,于15~20m生理盐水中100℃水浴10min 离心取上清备用。 方法Ⅱ:外周血提取DNA (1)白细胞的分离 ①抗凝血用1~2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水(PBS)稀释并混合。 ②在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液(上海试剂二厂),在上面 仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。 ③室温以2000pm离心15min~20min,红细胞应沉于管底,而白色的淋巴 细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。 ④吸弃血浆,小心吸取淋巴细胞层,直至把淋巴细胞转移完全 ⑤用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次。5′-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3′） 2. 试剂（实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理） 生理盐水、细胞裂解液（50mmol Tris-HCl，pH 8.0；1mmol Na2 EDTA ，pH 8.0；0.5% SDS；0.1mmol NaCl）、10mg/ml 蛋白酶 K 、20%SDS 、水饱和酚(1mol/L Tris-HCl 抽提)、酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）、氯仿：异戊醇（24∶1）、8mol/L 醋酸钾、无水乙醇、70%乙醇、TE（pH8.0）（10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；0.1 mmol/L Na2EDTA，pH8.0）、10×buffer（500mmol/L KCl、100mmol/L Tris·HCl，pH8.3， 室温 15mmol/L MgCl2；0.1% 明胶）、4×dNTP（1 mmol/LdATP，1 mmol/L dCTP， 1 mmol/L dGTP，1 mmol/L dTTP）、Taq 酶（1U/μl）、引物溶液（10pmol/μl）、5×TBE 缓冲液（1000ml）（54g Tris 碱，27.5g 硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA，pH8.0）、DNA 分子量标记、2%琼脂糖凝胶、载样缓冲液（100ml）（0.2%溴酚蓝，50%蔗糖， 10mol/L NaOH 12 滴）、10mg/ml 溴化乙锭溶液（戴手套谨慎称取溴化乙锭约 200mg，放入棕色瓶中，加重蒸水 20ml，溶解后置 4℃冰箱保存备用。使用时 100ml 琼脂糖凝胶中加 5μl 10mg/ml 溴化乙锭溶液，终浓度为 0.5μg/ml）。 3. 实验仪器 PCR 扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳 槽、紫外检测仪。 （三）实验步骤 1. DNA 模板制备 方法Ⅰ：取毛发 12 根，尽量剪碎，于 1520ml 生理盐水中 100℃水浴 10min， 离心取上清备用。 方法Ⅱ：外周血提取 DNA （1）白细胞的分离 ①抗凝血用 1～2 倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。 ②在 50ml 离心管中加入 1 倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面 仔细铺一层 2 倍体积已稀释的血液。 ③室温以 2000rpm 离心 15min～20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴 细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。 ④吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。 ⑤用生理盐水或 PBS 洗淋巴细胞二次