⑥最后得到的淋巴细胞沉淀,可立即用于DNA的提取,或冻存于超低温冰 箱中,直至使用。 (2)DNA的提取(见本篇第一章)。 2.PCR反应体系配制及扩增 (1)PCR反应总体积50ul,取一洁净的0.5 ml Eppendorf管,依次加入: 0× buffer dNTP 5ul 引物1 引物2 2.5u 模板DNA 10ul Taq dna daHaO 补足50ul (2)将反应管放入PCR扩增仪上进行聚合酶链反应,条件为94℃变性10min 后,94℃45s、55℃45s、72℃90s共30个循环;最末一个循环紧接72℃再延伸 l0min。 3.扩增产物电泳检测 取PCR扩增产物10ul与2山l上样缓冲液混合后,与 DNA Marker同时进行 琼脂糖凝胶电泳。电泳结束,取出凝胶置于紫外检测仪上观察。 (四)注意事项 实验过程应设阴性及阳性模板对照。 2.PCR常见问题及解决办法 (1)没有得到预期的PCR扩增产物:①确证聚合酶的活性是否正常;② DNA解链是否充分,变性温度是否准确;③引物组成是否正确,有无二级结构 组成;④反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在,使聚合酶或模板及产物降解。 (2)有非特异性扩增产物出现:①增加复性温度,缩短复性时间及延伸时 间;②降低引物和 Taq dna聚合酶的用量;③调整Mg2+浓度;④减少热循环次 (3)形成了引物二聚体:①检查引物的序列,特别是3′端是否有互补区⑥最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于 DNA 的提取，或冻存于超低温冰 箱中，直至使用。 （2）DNA 的提取（见本篇第一章）。 2. PCR 反应体系配制及扩增 （1）PCR 反应总体积 50μl，取一洁净的 0.5ml Eppendorf 管，依次加入： 10×buffer 5μl dNTP 5μl 引物 1 2.5μl 引物 2 2.5μl 模板 DNA 10μl Taq DNA 2U d3H2O 补足 50μl （2）将反应管放入 PCR 扩增仪上进行聚合酶链反应，条件为 94℃变性 10min 后，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 90s 共 30 个循环；最末一个循环紧接 72℃再延伸 10min。 3. 扩增产物电泳检测 取 PCR 扩增产物 10μl 与 2μl 上样缓冲液混合后，与 DNA Marker 同时进行 琼脂糖凝胶电泳。电泳结束，取出凝胶置于紫外检测仪上观察。 （四）注意事项 1. 实验过程应设阴性及阳性模板对照。 2. PCR 常见问题及解决办法 （1）没有得到预期的 PCR 扩增产物：①确证聚合酶的活性是否正常；② DNA 解链是否充分，变性温度是否准确；③引物组成是否正确，有无二级结构 组成；④反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在，使聚合酶或模板及产物降解。 （2）有非特异性扩增产物出现：①增加复性温度，缩短复性时间及延伸时 间；②降低引物和 Taq DNA 聚合酶的用量；③调整 Mg2+浓度；④减少热循环次 数。 （3）形成了引物二聚体：①检查引物的序列，特别是 3′端是否有互补区；