②增加引物的长度;③调整引物与模板浓度,使模板比例増髙,降低引物使用浓 度;④增加复性温度;⑤减少热循环次数。 (4)PCR产物在凝胶电泳中成片状:①减少 Taq dna聚合酶的用量:②增 加复性温度,减少复性时间及延伸时间;③降低Mg2浓度;④减少循环次数: ⑤从凝胶中回收与预期分子量相同的DNA,再次进行PCR反应 3.实验安全 溴化乙锭是强诱变剂,并有中度毒性,取用含有这一染料的溶液时务必戴上 手套,这些溶液经使用后,应进行净化处理 第二节单链构象多态性(SSCP)分析 单链构象多态性( single strand conformation polymorphism,SSCP)分析是 利用DNA或RNA单链构象具有多态性的特点,结合PCR进行基因检测的一种 分析技术,称为 PCR-SSCP技术。其基本原理为:DNA或cDNA在变性后,由 于序列的不同而导致单链DNA的空间结构各异。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 的过程中,不同空间结构的单链DNA迁移率存在差异。因此, PCR-SSCP可以 用来鉴定单核苷酸的差异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测 遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域 PCR-SSCP的敏感性随核苷酸片段长度的增加而降低,在检测200个核苷酸 片段中单个碱基的突变时,检出率高达90%;而400个核苷酸片段单个碱基突变 的检出率为80%。因而,在实验中要将大片段分成较短的片段。哺乳动物基因组 中的外显子一般小于300个碱基,可以使用内含子引物直接对目的片段进行 PCR-SSCP。 、 PCR-SSCP技术的基本程序 PCR-SSCP技术的基本程序为:首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产 物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰 胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取 决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有 一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部②增加引物的长度；③调整引物与模板浓度，使模板比例增高，降低引物使用浓 度；④增加复性温度；⑤减少热循环次数。 （4）PCR 产物在凝胶电泳中成片状：①减少 Taq DNA 聚合酶的用量；②增 加复性温度，减少复性时间及延伸时间；③降低 Mg2+浓度；④减少循环次数； ⑤从凝胶中回收与预期分子量相同的 DNA，再次进行 PCR 反应。 3. 实验安全 溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上 手套，这些溶液经使用后，应进行净化处理。 第二节 单链构象多态性（SSCP）分析 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）分析是 利用 DNA 或 RNA 单链构象具有多态性的特点，结合 PCR 进行基因检测的一种 分析技术，称为 PCR-SSCP 技术。其基本原理为：DNA 或 cDNA 在变性后，由 于序列的不同而导致单链 DNA 的空间结构各异。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 的过程中，不同空间结构的单链 DNA 迁移率存在差异。因此，PCR-SSCP 可以 用来鉴定单核苷酸的差异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、 遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。 PCR-SSCP 的敏感性随核苷酸片段长度的增加而降低，在检测 200 个核苷酸 片段中单个碱基的突变时，检出率高达 90%；而 400 个核苷酸片段单个碱基突变 的检出率为 80%。因而，在实验中要将大片段分成较短的片段。哺乳动物基因组 中的外显子一般小于 300 个碱基，可以使用内含子引物直接对目的片段进行 PCR-SSCP。 一、PCR-SSCP 技术的基本程序 PCR-SSCP 技术的基本程序为：首先 PCR 扩增特定靶序列，然后将扩增产 物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰 胺凝胶中电泳时，DNA 单链的迁移率除与 DNA 链的长短有关外，更主要的是取 决于 DNA 单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA 单链可自身折叠形成具有 一定空间结构的构象。这种构象由 DNA 单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部