顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同,甚 至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同。PCR产物变性后, 单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,靶DNA中含单碱基置换,或数个碱基插 入或缺失等改变时,因迁移率变化会出现泳动变位,从而可将变异DNA与正常 DNA区分开。由此可见, PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术, 它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变 化来检测基因变异 二、实验准备 (一)试剂 甲酰胺加样缓冲液(95%甲酰胺,20 mMOL/L EDTA,0.05%溴酚蓝和0.05% 甲苯青)、6%丙烯酰胺(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺=49:1)、10%甘油 0.5×TBE、10%醋酸、2%硝酸银、显影液(3%无水碳酸钠,0.2%甲醛,0.02%硫 代硫酸钠)、去离子水 (二)实验仪器 PCR扩增仪、超净工作台、髙速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测 仪 、实验步骤 1.目的片段的PCR及其产物的变性根据扩增的目的片段制定PCR扩增 条件。PCR扩增结束后,用5倍体积的甲酰胺加样缓冲液混合。将样品于95℃ 变性5min并直接置于冰浴上。 2.电泳电泳胶有两种:①聚丙烯酰胺凝胶由6%丙烯酰胺、10%甘油和 0.5×TBE组成。上样5μ,在室温下0.5W/cm,用0.5×BE电极缓冲液电泳25h 以上;②聚丙烯酰胺凝胶由6%丙烯酰胺和0.5×TBE组成。上样5μ,在4℃下 0.5Wcm,用0.5×TBE电极缓冲液电泳25h以上 3.染色取下凝胶,置10%醋酸固定液中30min,再以去离子水漂洗3次 (2min次),加入2%硝酸银染液染色20min后,去离子水洗胶20s,凝胶置显 影液中显色5~10min,以10%醋酸终止反应,漂洗及分析结果 4.结果判读SSCP结果判读的标准是正常个体由于等位基因相同,仅存在 两条单链,因此在凝胶上多出现两条带,有时由于两条链接近可形成一条带,或顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的 DNA 单链其顺序不同，甚 至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR 产物变性后， 单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶 DNA 中含单碱基置换，或数个碱基插 入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异 DNA 与正常 DNA 区分开。由此可见，PCR-SSCP 分析技术是一种 DNA 单链凝胶电泳技术， 它根据形成不同构象的等长 DNA 单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变 化来检测基因变异。 二、实验准备 （一）试剂 甲酰胺加样缓冲液（95%甲酰胺，20mmoL/L EDTA，0.05%溴酚蓝和 0.05% 二甲苯青）、6%丙烯酰胺（丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺=49∶1）、10%甘油、 0.5×TBE、10%醋酸、2%硝酸银、显影液（3%无水碳酸钠，0.2%甲醛，0.02%硫 代硫酸钠）、去离子水 （二）实验仪器 PCR 扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测 仪。 三、实验步骤 1．目的片段的 PCR 及其产物的变性 根据扩增的目的片段制定 PCR 扩增 条件。PCR 扩增结束后，用 5 倍体积的甲酰胺加样缓冲液混合。将样品于 95℃ 变性 5min 并直接置于冰浴上。 2．电泳 电泳胶有两种：①聚丙烯酰胺凝胶由 6%丙烯酰胺、10%甘油和 0.5×TBE 组成。上样 5μl，在室温下 0.5W/cm，用 0.5×TBE 电极缓冲液电泳 2.5h 以上；②聚丙烯酰胺凝胶由 6%丙烯酰胺和 0.5×TBE 组成。上样 5μl，在 4℃下 0.5 W/cm，用 0.5×TBE 电极缓冲液电泳 2.5h 以上。 3．染色 取下凝胶，置 10%醋酸固定液中 30min，再以去离子水漂洗 3 次 （2min/次），加入 2%硝酸银染液染色 20min 后，去离子水洗胶 20s，凝胶置显 影液中显色 5～10min，以 10%醋酸终止反应，漂洗及分析结果。 4．结果判读 SSCP 结果判读的标准是正常个体由于等位基因相同，仅存在 两条单链，因此在凝胶上多出现两条带，有时由于两条链接近可形成一条带，或