条单链有两种空间结构可形成三条带;突变个体由于等位基因不同,可以形成 四种不同的单链,因此在凝胶上多出现四条带,有时也可形成五条带。如果存在 复杂突变,可以形成超过5条的带纹(图2-3-1)。 图2-31SCP结果图(为未变性的PCR产物2、4、6、8、9为正常个体;3、5、 为突变携带者) 四、注意事项 核酸片段的大小是决定检测敏感性的首要因素:用于SSCP分析的核酸 片段越小,检测的敏感性越高。对于大于400bp的PCR产物可采用以下两种策 略进一步处理:①用限制性内切酶对PCR产物进行消化,产生较小片段;②通 过改变引物的位置和增加PCR扩增次数,缩短PCR产物 2.聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是影响检测敏感性的另一个重要的因素: 般情况下,丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为49:1。可以选用10%甘油在室 温或无甘油在4℃条件下进行电泳。 3.游离引物:游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率,即使游离引 物量为6nM都有明显影响。因此,应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引 物扩增方法,尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR 产物。或者是稀释PCR产物,减少游离引物的干扰 4.低浓度变性剂:凝胶中加入低浓度的变性剂,如5%~10%甘油、5%尿 素或甲酸胺、10%二甲亚砜(DMSO)或蔗糖等有助于提髙敏感性,可能是因为 轻微改变单链DNA的构象,增加分子的表面积,降低单链DNA的泳动率。但 有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此,对同一序列使用2~3 种条件做SSCP,可能提高敏感性。 5.电泳温度:一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素,温 度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象,从而影 响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况,但由于在电泳时温度会升高,为确一条单链有两种空间结构可形成三条带；突变个体由于等位基因不同，可以形成 四种不同的单链，因此在凝胶上多出现四条带，有时也可形成五条带。如果存在 复杂突变，可以形成超过 5 条的带纹（图 2-3-1）。 图 2-3-1 SSCP 结果图（1 为未变性的 PCR 产物;2、4、6、8、9 为正常个体；3、5、7 为突变携带者） 四、注意事项 1. 核酸片段的大小是决定检测敏感性的首要因素： 用于 SSCP 分析的核酸 片段越小，检测的敏感性越高。对于大于 400bp 的 PCR 产物可采用以下两种策 略进一步处理：①用限制性内切酶对 PCR 产物进行消化，产生较小片段；②通 过改变引物的位置和增加 PCR 扩增次数，缩短 PCR 产物。 2. 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是影响检测敏感性的另一个重要的因素：一 般情况下，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为 49∶1。可以选用 10%甘油在室 温或无甘油在 4℃条件下进行电泳。 3. 游离引物：游离引物可能同 PCR 产物结合而改变其泳动率，即使游离引 物量为 6nM 都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引 物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化 PCR 产物。或者是稀释 PCR 产物，减少游离引物的干扰。 4. 低浓度变性剂：凝胶中加入低浓度的变性剂，如 5％～10％甘油、5％尿 素或甲酸胺、10％二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为 轻微改变单链 DNA 的构象，增加分子的表面积，降低单链 DNA 的泳动率。但 有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用 2～3 种条件做 SSCP，可能提高敏感性。 5. 电泳温度：一般认为保持凝胶内温度恒定是 SSCP 分析最关键的因素，温 度有可能直接影响 DNA 分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影 响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确