保电泳温度相对恒定,应采取以下措施:减少凝胶厚度,降低电压,有效的空气 冷却或循环水冷却等。 6.凝胶的长度:可用测序板进行SSCP分析,凝胶板长度在40cm以上。 7.凝胶浓度及厚度:凝胶浓度很重要,一般使用5%~8%的凝胶,凝胶浓 度不同,突变带的相对位置也不相同,如果在进行未知突变种类的SSCP分析时, 最好采用两种以上凝胶浓度,这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对 SSCP分析也很重要,凝胶越厚,背景越深,在上样量较多的前提下,尽量使凝 胶越薄越好。 8.假阴性:一般认为,如没有污染,PCR-SSCP分析不存在假阳性结果, 但可能出现假阴性结果,后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微,迁移率相 差无几所致,尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照, 结果可以重复确定的突变带是可信的,如果没有阳性对照,应经测序来确定其是 否为突变带。由于PCR一SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过 设置阳性对照,摸索电泳条件,假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未 知基因变异的检测,假阴性结果就难以百分之百地消除。 9.结果分析:单链凝胶电泳时,互补单链迁移率不同,一般形成两条单链 带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前,通过加热变性产生单链。如变性不彻底, 残留双链亦可形成一条带.因此,PCR一SSCP分析结果至少显示三条带。但是 由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象,检出三条或四条单链带就不足 为奇。 第三节基因表达谱研究技术 人类基因组大约有30000个左右的结构基因,其中在任一细胞中表达的基因 仅占总数的15%管家基因在任何生长发育阶段以及生理状态下均有所表达,而 奢侈基因的表达则有组织特异性、时空特异性以及调节特异性。两者同时决定了 包括发育与分化、内环境稳定( homeostat)、对逆境的反应、细胞周期调控、衰 老乃至程序化死亡等整个生命过程。基因表达的变化是调控生命活动过程的核心 机制。通过比较同一类或不同种类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气 冷却或循环水冷却等。 6. 凝胶的长度： 可用测序板进行 SSCP 分析，凝胶板长度在 40cm 以上。 7. 凝胶浓度及厚度： 凝胶浓度很重要，一般使用 5％～8％的凝胶，凝胶浓 度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的 SSCP 分析时， 最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对 SSCP 分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝 胶越薄越好。 8. 假阴性：一般认为，如没有污染，PCR－SSCP 分析不存在假阳性结果， 但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相 差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照， 结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是 否为突变带。由于 PCR－SSCP 的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过 设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未 知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。 9. 结果分析：单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链 带。PCR 产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底， 残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP 分析结果至少显示三条带。但是， 由于一种 DNA 单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足 为奇。 第三节 基因表达谱研究技术 人类基因组大约有 30000 个左右的结构基因，其中在任一细胞中表达的基因 仅占总数的 15%。管家基因在任何生长发育阶段以及生理状态下均有所表达，而 奢侈基因的表达则有组织特异性、时空特异性以及调节特异性。两者同时决定了 包括发育与分化、内环境稳定(homeostans)、对逆境的反应、细胞周期调控、衰 老乃至程序化死亡等整个生命过程。基因表达的变化是调控生命活动过程的核心 机制。通过比较同一类或不同种类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段