李振华等:氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展 测限高于样品所规定的最高残留限量(MRLs)。结合高压免疫亲和反相液相色谱柱来分析牛血清 Kerman(1998年)报道了用改进的欧洲四平皿法中FQNs,如环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟 ( fourplate test,FPT)检测市场零售肉中恩诺沙星沙星。采用蛋白G交联柱自动除去对分析有干扰 和环丙沙星的残留情况。微生物抑制分析法的血浆成分,高压免疫亲和色谱柱,共价结合抗沙拉 MIA)用来检测喹诺酮类药物已有报道,通常的操沙星抗体,特异捕获FQNs类物质,其他血清成分 作方法是将组织和抗微生物药物均匀分散到琼脂培被冲洗掉,之后FQNs类物质被洗脱,进行反相 养皿中抑制微生物的生长。喹诺酮类药物使用敏感HPLC分析,荧光检测器检测,激发波长和发射波长 的大肠埃希菌菌株,用于特异性的生物体 分别为280nm和444nm。样品进样前只需要在磷 挪威已经制定了MIA作为鱼类药物残留筛选酸缓冲液中稀释,经0.2mm筛过滤以除去细小微 的官方分析方法。将经处理的鱼肝组织置于接种有粒物质即可。在牛血清中4种FQNs类物质的回收 大肠埃希菌ATCC11303菌株的营养琼脂培养皿率大于95%,而且重复性很好 中,培养过夜,测量抑菌圈的面积,对所有阳性者或2定量分析方法 可疑者用高效液相色谱法进行确证。据报道,这种2.1高效液相色谱法 方法对肌肉样品的检测限为50×10mo/L。其他 高效液相色谱法(HPLC是在经典液相层析法 喹诺酮类药物MIA检测方法也有报导。MIA方法基础上,引进了气相层析的理论,具有气相层析的全 的灵敏度基本符合分析者所期望的水平和规定的最部优点,分离能力强、测定灵敏度高,可在室温下进 高残留限量(MRLs)。尽管如此,在所期望的检测行,应用范围极广 水平下阴性样品的可靠性不能保证。例如,使用大 丁焕中等报道了血浆中沙拉沙星浓度测定的 肠埃希菌ATcC1175株和水提取的组织,对奥索HPLC法,血浆样品经甲醇沉淀血浆蛋白,高速离 利酸、氟甲喹和萘啶酸的检测灵敏度仅达250×心,取上清液作HPLC检测。色谱条件: NovarpakC 10°mol/L~300×10°mol/L。郑晶等用MIA不锈钢色谱柱,流动相为乙腈四丁基溴化铵溶液 与酶联免疫分析法检测了氟喹诺酮类药物的残留,流速1.0mL/min。荧光检测器激发波长278nr 并对这两种方法进行了比较,MIA更适合这类药物发射波长460nm。 的检测。 张国文等采用高效液相色谱荧光检测法测定 1.2免疫分析测定法 鳗鱼中4种氟喹诺酮类(乳酸左氧氟沙星、诺氟沙 免疫分析方法广泛地应用于临床诊断领域,最星、乳酸环丙沙星和恩诺沙星)药物残留量,检测限 近被应用于可食组织中的药物残留检测。这种方法分别为0.0110.023、0.010.031ug/mL。对空白 使用特定的抗体识别目标药物,目标药物和标记药样进行3个水平(0.05、0.1、0.2mg/kg)加标回收 物互相竞争性地与特异性抗体进行结合,形成药物测定,回收率在86.5%~106.4%之间 抗体复合物,通过复合物和酶结合显示的颜色或底 刘媛等用高效液相色谱同时测定鸡蛋中4种 物的颜色来进行分析。FQNs结构中含有羧基,多氟喹诺酮类药物的残留。对鸡蛋样品的提取及其在 采用FQNs羧基与载体蛋白质游离氨基的缩合反CI8固相萃取柱上的净化条件进行了研究,采用高 应,将FQNs与载体连接合成人工抗原,方法简单,效液相色谱分离,荧光检测器检测(λex=280nm 用于兽药残留分析可使分析过程大大简化。 λem=450nm),外标法定量。4种沙星标准曲线的 Sint koff等报道了血清中环丙沙星(CIP)的间线性回归系r数均在0.9999以上,环丙沙星、恩诺 接竞争EISA测定法。首先利用N羟基琥珀酰亚沙星、沙拉沙星的线性范围为2.5μg/L 胺活性酯法( NHS- EDC)将CIP与KLH和BSA连500μg/L,达诺沙星为0.5ugL~100ug/L。鸡 接制备结合物, KL H-CIP免疫新西兰白兔,制备抗蛋样品中4种沙星的加标回收率为78.1%~ 血清。BSA-CIP作包被原,采用1:3200抗血清工95.7%相对标准偏差为RSD4.1%~16.2%。环 作浓度,抑制曲线的ICso≈1ngmL。但由于FQNs丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的最低检出限为10 主要结构部分相同或相近,因此,某一FQNs的抗g/kg,达诺沙星的最低检出限为2ug/kg 体一般与其他FQNs存在一定交叉反应。故该法 董琳琳等叩用反相高效液相色谱法同时测定 不适合作残留确证,只适用于快速筛选 4种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙 1.3免疫亲和色谱液相色谱法 星和沙拉沙星)在鸡可食性组织中的残留,其中环丙 Holtzapple C k等报道,采用在线纯化,同时沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的定量检出限为 91994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net测限高于样品所规定的最高残留限量 ( MRL s) 。 Okerman (1998 年) 报道了用改进的欧洲四平皿法 (four2plate test ,FPT) 检测市场零售肉中恩诺沙星 和环丙沙星的残留情况[1 ] 。微生物抑制分析法 (MIA) 用来检测喹诺酮类药物已有报道 ,通常的操 作方法是将组织和抗微生物药物均匀分散到琼脂培 养皿中抑制微生物的生长。喹诺酮类药物使用敏感 的大肠埃希菌菌株 ,用于特异性的生物体。 挪威已经制定了 MIA 作为鱼类药物残留筛选 的官方分析方法。将经处理的鱼肝组织置于接种有 大肠埃希菌 A TCC 11303 菌株的营养琼脂培养皿 中 ,培养过夜 ,测量抑菌圈的面积 ,对所有阳性者或 可疑者用高效液相色谱法进行确证。据报道 ,这种 方法对肌肉样品的检测限为 50 ×10 - 9 mol/ L 。其他 喹诺酮类药物 MIA 检测方法也有报导。MIA 方法 的灵敏度基本符合分析者所期望的水平和规定的最 高残留限量 (MRLs) 。尽管如此 ,在所期望的检测 水平下阴性样品的可靠性不能保证。例如 ,使用大 肠埃希菌 A TCC11775 株和水提取的组织 ,对奥索 利酸、氟甲喹和萘啶酸的检测灵敏度仅达 250 × 10 - 9 mol/ L～300 ×10 - 9 mol/ L 。郑晶等[2 ] 用 MIA 与酶联免疫分析法检测了氟喹诺酮类药物的残留 , 并对这两种方法进行了比较 ,MIA 更适合这类药物 的检测。 1. 2 免疫分析测定法 免疫分析方法广泛地应用于临床诊断领域 ,最 近被应用于可食组织中的药物残留检测。这种方法 使用特定的抗体识别目标药物 ,目标药物和标记药 物互相竞争性地与特异性抗体进行结合 ,形成药物 抗体复合物 ,通过复合物和酶结合显示的颜色或底 物的颜色来进行分析。FQNs 结构中含有羧基 ,多 采用 FQNs 羧基与载体蛋白质游离氨基的缩合反 应 ,将 FQNs 与载体连接合成人工抗原 ,方法简单 , 用于兽药残留分析可使分析过程大大简化。 Sint koff 等报道了血清中环丙沙星 (CIP) 的间 接竞争 EL ISA 测定法。首先利用 N2羟基琥珀酰亚 胺活性酯法(N HS2EDC) 将 CIP 与 KL H 和 BSA 连 接制备结合物 , KL H2CIP 免疫新西兰白兔 ,制备抗 血清。BSA2CIP 作包被原 ,采用 1 ∶3 200 抗血清工 作浓度 ,抑制曲线的 IC50≈1 ng/ mL 。但由于 FQNs 主要结构部分相同或相近 ,因此 ,某一 FQNs 的抗 体一般与其他 FQNs 存在一定交叉反应。故该法 不适合作残留确证 ,只适用于快速筛选。 1. 3 免疫亲和色谱2液相色谱法 Holtzapple C K等[3 ]报道 ,采用在线纯化 ,同时 结合高压免疫亲和2反相液相色谱柱来分析牛血清 中 FQNs ,如环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟 沙星。采用蛋白 G2交联柱自动除去对分析有干扰 的血浆成分 ,高压免疫亲和色谱柱 ,共价结合抗沙拉 沙星抗体 ,特异捕获 FQNs 类物质 ,其他血清成分 被冲洗掉 ,之后 FQNs 类物质被洗脱 ,进行反相 HPLC 分析 ,荧光检测器检测 ,激发波长和发射波长 分别为 280 nm 和444 nm。样品进样前只需要在磷 酸缓冲液中稀释 ,经 0. 2 mm 筛过滤以除去细小微 粒物质即可。在牛血清中 4 种 FQNs 类物质的回收 率大于 95 % ,而且重复性很好。 2 定量分析方法 2. 1 高效液相色谱法 高效液相色谱法( HPLC) 是在经典液相层析法 基础上 ,引进了气相层析的理论 ,具有气相层析的全 部优点 ,分离能力强、测定灵敏度高 ,可在室温下进 行 ,应用范围极广。 丁焕中等[4 ]报道了血浆中沙拉沙星浓度测定的 HPLC 法 ,血浆样品经甲醇沉淀血浆蛋白 ,高速离 心 ,取上清液作 HPLC 检测。色谱条件 :Nova2pakC 不锈钢色谱柱 ,流动相为乙腈2四丁基溴化铵溶液 , 流速 1. 0 mL/ min。荧光检测器激发波长 278 nm , 发射波长 460 nm。 张国文等[5 ]采用高效液相色谱荧光检测法测定 鳗鱼中 4 种氟喹诺酮类 (乳酸左氧氟沙星、诺氟沙 星、乳酸环丙沙星和恩诺沙星) 药物残留量 ,检测限 分别为 0. 011、0. 023、0. 01、0. 031μg/ mL 。对空白 样进行 3 个水平 (0. 05、0. 1、0. 2 mg/ kg) 加标回收 测定 ,回收率在 86. 5 %～106. 4 %之间。 刘媛等[6 ]用高效液相色谱同时测定鸡蛋中 4 种 氟喹诺酮类药物的残留。对鸡蛋样品的提取及其在 C18 固相萃取柱上的净化条件进行了研究 ,采用高 效液相色谱分离 ,荧光检测器检测 (λex = 280 nm , λem = 450 nm) ,外标法定量。4 种沙星标准曲线的 线性回归系 r 数均在 0. 999 9 以上 ,环丙沙星、恩诺 沙星、沙 拉 沙 星 的 线 性 范 围 为 2. 5 μg/ L ～ 500μg/ L ,达诺沙星为 0. 5 μg/ L ～100 μg/ L 。鸡 蛋样 品 中 4 种 沙 星 的 加 标 回 收 率 为 78. 1 % ～ 95. 7 % ,相对标准偏差为 RSD 4. 1 %～16. 2 %。环 丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的最低检出限为 10 μg/ kg ,达诺沙星的最低检出限为 2μg/ kg。 董琳琳等[7 ] 用反相高效液相色谱法同时测定 4 种氟喹诺酮类药物 (环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙 星和沙拉沙星) 在鸡可食性组织中的残留 ,其中环丙 沙星、恩 诺 沙 星、沙 拉 沙 星 的 定 量 检 出 限 为 李振华等 :氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展 99