实验五DNA的限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 1.掌握DNA限制性内切酶酶切的原理及方法： 2.掌握琼脂糖凝胶检测DNA的原理及方法。 二、实验原理 1.限制性核酸内切酶 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水 解酶，它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。这些酶可在特 定位点切开DNA,产生可体外连接的基因片段。按限制酶的亚基组成和切 断核酸情况的不同，分为三类：I型、Ⅱ型和型。第一类(1型)限制 性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割 DNA链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶 在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆 基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第三类(II型)限制性内切酶也有专 的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几 个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切药切割后产生的一定长 度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。第二类 型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切 割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此， 这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别 的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸 以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种 方式：粘性末端和平头末端。粘性末端是交错切割，结果形成两条单链末端， 这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键。平头末端：型酶在同一位 置上切割双链，产生平头末端。 每一种限制性内切酶都有特定的反应条件和储存缓冲液。具体的使用 可以参考工具书或产品的说明书。一般来讲，反应的最适温度为37℃，H 5~8.0。典型的反应体系包括1μg的DNA,1unit酶和1×缓冲液。反应体 积控制在20~50μL之间。反应的时间一般为1小时。反应结束后，可以加 入终止缓冲液（含有EDTA,整合核酸酶活性所必需的金属离子）终止反应， 也可以通过70℃加热10分钟使内切酶变性而终止反应。 2.DNA的琼脂糖凝胶电泳 分离、纯化和鉴定DNA常用的方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝 胶电泳两种。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂 糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从12 实验五 DNA 的限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳 一、 实验目的 1. 掌握 DNA 限制性内切酶酶切的原理及方法； 2. 掌握琼脂糖凝胶检测 DNA 的原理及方法。 二、 实验原理 1. 限制性核酸内切酶 限制性内切酶是一类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水 解酶，它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。这些酶可在特 定位点切开 DNA，产生可体外连接的基因片段。按限制酶的亚基组成和切 断核酸情况 的不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。第一类（I 型）限制 性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割 DNA 链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶 在 DNA 重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析 DNA 结构或克隆 基因。这类酶如 EcoB、EcoK 等。 第三类（III 型）限制性内切酶也有专一 的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几 个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长 度 DNA 片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。第二类(II 型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切 割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此， 这种限制性内切酶是 DNA 重组技术中最常用的工具酶之一。 这种酶识别 的专一核苷酸顺序最常见的是 4 个或 6 个核苷酸，少数也有识别 5 个核苷酸 以及 7 个、8 个、9 个、10 个和 11 个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种 方式：粘性末端和平头末端。粘性末端是交错切割，结果形成两条单链末端， 这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键。平头末端：II 型酶在同一位 置上切割双链，产生平头末端。 每一种限制性内切酶都有特定的反应条件和储存缓冲液。具体的使用 可以参考工具书或产品的说明书。一般来讲，反应的最适温度为 37℃，pH 5~8.0。典型的反应体系包括 1μg 的 DNA，1unit 酶和 1×缓冲液。反应体 积控制在 20~50μL 之间。反应的时间一般为 1 小时。反应结束后，可以加 入终止缓冲液（含有 EDTA，螯合核酸酶活性所必需的金属离子）终止反应， 也可以通过 70℃加热 10 分钟使内切酶变性而终止反应。 2. DNA 的琼脂糖凝胶电泳 分离、纯化和鉴定 DNA 常用的方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝 胶电泳两种。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂 糖凝胶分离 DNA 片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从