第四章单克隆杭体 (一）组织培养材料的准备 1,主要设备 一般有组织培养能力的实验室均具有研制杂交瘤的基本条件。主要的仪器设备包括：超 净工作台、C02恒温培养箱、倒置光学显微镜、普通显微镜、离心机、液氨储存器、水浴恒 温装置、冰箱、培养液过滤装置、多孔培养板、塑料器皿及其它实验室常用的材料。 2.组织培养用水 一般都采用去离子水，将蒸馏水经超滤装置过滤后，即可除去其中的绝大部分离子。在 整个实验过程中都应该使用符合规格的用水。 3.培养基 制备单克隆抗体最常用的培养基有两种， 一种是改良的Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)。DMEM又有高糖(4500mgL)和低糖(1000mgL)两种。用于小鼠融 合的常为高糖DMEM。另一种为RPM-I64O。配制时干粉制剂搅全溶后，加水到需要的 体积，这样可以保证培养液的渗透压。经除菌过滤分装之后，即可保存于冰箱中，同时取少 量培养液进行培养证明其无茵，使用前根据需要再加入适量的牛血清、抗生素、碳酸氢钠、 丙酮酸盐和谷氨酰胺等成分，制备完全培养基所添加的各种成分都需要事先检菌。 4。血清 常用胎牛血清，但国内多数实验室常使用新生小牛血清，原因是新生小牛血清比胎牛血 清更便宜。不同来源及批号的血清对杂交瘤细胞的生长有明显差异。因此在实验前必须对不 同来源及批号的血清进行仔细的筛选检查，筛选出能支持单细胞生长或使细胞迅速增殖的血 清。在外观上稍有溶血而使血清中含有少量的血红蛋白并不影响其质量。常用的方法是用 株骨髓瘤细胞及两株杂交瘤细胞按有限稀释法(limited dilution)将细跑接种于若干个平行 孔，细胞培养液为含20%胎牛血清的DMEM或RPM-1640完全培养液，并于培养后3d、 7d、10d观察细胞增殖的情况，择优选用。 胎牛血清中球蛋白含量很低，一般不会影响杂交瘤细胞抗体分泌或抗体特异性的筛选。 此外胎生血清还含有一些生长刺激因子能促讲杂交瘤细胞的生长。如补充一些马血清，融合 细胞可迅速生长，同时又可节省一些胎牛血清。对于融合亲代细胞的培养一般采用含10% 胎牛血清培养基。但在融合、筛选及随后的克隆中一般用含20%的胎牛血清培养基。一旦 筛选出所需要的杂交瘤细胞后，可以将胎牛血清浓度逐步降低到10%或低至5%，使细胞缓 慢生长，以作为常规维持培养 根据需要在用前可以将胎牛血清灭活，即放在56℃水浴中温有30mi,以破坏血清中 补体的活性。也有报道在56℃加温45mn可以杀伤支原体。灭活前将在-20℃冻存的胎牛 血清取出，放在室温或4℃冰箱中待其自然解冻，将解冻的胎牛血清充分混匀后再放到56℃ 的恒温水浴中，温热30m,其间将血清瓶摇动混匀数次。将筛选灭活的牛血清或其它血清 分装成每次需要的数量，20℃保存。反复冻融会影响血清的质量。 5.抗生素 由于杂交瘤制备步骤多，持续培养的时间长，加之操作的误差和环境条件的不良常常会 -53 第四章 单克隆抗体 - 53 - (一) 组织培养材料的准备 1． 主要设备 一般有组织培养能力的实验室均具有研制杂交瘤的基本条件。主要的仪器设备包括：超 净工作台、CO2恒温培养箱、倒置光学显微镜、普通显微镜、离心机、液氮储存器、水浴恒 温装置、冰箱、培养液过滤装置、多孔培养板、塑料器皿及其它实验室常用的材料。 2． 组织培养用水 一般都采用去离子水，将蒸馏水经超滤装置过滤后，即可除去其中的绝大部分离子。在 整个实验过程中都应该使用符合规格的用水。 3． 培养基 制备单克隆抗体最常用的培养基有两种，一种是改良的 Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）。DMEM 又有高糖（4500mg/L）和低糖（1000mg/L）两种。用于小鼠融 合的常为高糖 DMEM。另一种为 RPMI-1640。配制时干粉制剂搅拌全溶后，加水到需要的 体积，这样可以保证培养液的渗透压。经除菌过滤分装之后，即可保存于冰箱中，同时取少 量培养液进行培养证明其无菌，使用前根据需要再加入适量的牛血清、抗生素、碳酸氢钠、 丙酮酸盐和谷氨酰胺等成分，制备完全培养基所添加的各种成分都需要事先检菌。 4． 血清 常用胎牛血清，但国内多数实验室常使用新生小牛血清，原因是新生小牛血清比胎牛血 清更便宜。不同来源及批号的血清对杂交瘤细胞的生长有明显差异。因此在实验前必须对不 同来源及批号的血清进行仔细的筛选检查，筛选出能支持单细胞生长或使细胞迅速增殖的血 清。在外观上稍有溶血而使血清中含有少量的血红蛋白并不影响其质量。常用的方法是用一 株骨髓瘤细胞及两株杂交瘤细胞按有限稀释法（limited dilution）将细胞接种于若干个平行 孔，细胞培养液为含 20％胎牛血清的 DMEM 或 RPMI-1640 完全培养液，并于培养后 3d、 7d、10d 观察细胞增殖的情况，择优选用。 胎牛血清中球蛋白含量很低，一般不会影响杂交瘤细胞抗体分泌或抗体特异性的筛选。 此外胎牛血清还含有一些生长刺激因子能促进杂交瘤细胞的生长。如补充一些马血清，融合 细胞可迅速生长，同时又可节省一些胎牛血清。对于融合亲代细胞的培养一般采用含 10％ 胎牛血清培养基。但在融合、筛选及随后的克隆中一般用含 20％的胎牛血清培养基。一旦 筛选出所需要的杂交瘤细胞后，可以将胎牛血清浓度逐步降低到 10％或低至 5％，使细胞缓 慢生长，以作为常规维持培养。 根据需要在用前可以将胎牛血清灭活，即放在 56℃水浴中温育 30 min，以破坏血清中 补体的活性。也有报道在 56 ℃加温 45 min 可以杀伤支原体。灭活前将在-20℃冻存的胎牛 血清取出，放在室温或 4℃冰箱中待其自然解冻，将解冻的胎牛血清充分混匀后再放到 56 ℃ 的恒温水浴中，温热 30 min，其间将血清瓶摇动混匀数次。将筛选灭活的牛血清或其它血清 分装成每次需要的数量，-20 ℃保存。反复冻融会影响血清的质量。 5． 抗生素 由于杂交瘤制备步骤多，持续培养的时间长，加之操作的误差和环境条件的不良常常会