第四章单克隆杭保 使整个工作由于污染而功亏一篑。因此，避免污染是组织培养实验工作中不可轻视的一环， 常见的微生物污染丰要来自病臺、细菌、直菌及支原体。污染源主要来自于原代培养、血洁 实验室工作人员、污染的培养物及实验环境。避免污染的最好方法莫过于建立一个严格的实 验室管理制度和良好的无南操作技术，这包括对任何引入新细胞系进行仔细的检测，对所有 的组织培养试剂在使用前都应作细菌及真菌检查。 细菌的污染可以用抗生素来控制，然而常规在培养体系中加人抗生素会导致耐药株的选 择性繁殖，从而有可能使实验环境处于耐药株的污染中。尽管如此，培养体系中仍然常规地 加入青霉素100Uml和链莓素100μgml。当有青、链霉素耐药株出现时，则可加入庆大霉 素(entamycin)0.2mg/ml或卡那霉素(kanamycin)50Oug/ml,但这种处理的效果并不好。 真菌的污染是难以防范的。这主要是由于温热湿润的条件是霉菌生长的良好环境。定期 清洁有助于控制真南的污染。虽然在培养中加入两性霉素B(fungizone,ampholericin B, 5~10ugml)或制霉菌素(mycostatin,100μgml)可以控制某些真菌的生长，然而一旦发 生真菌污染，往往也无能为力。这是因为真菌生长迅速，这两种抗生素的用量稍大也会影响 杂交瘤细胞的生长，所以当发现有真菌污染时最好的方法是将其销毁，也可以在有真菌的孔 中加入lmoL氢氧化钠或2molL硫酸铜溶液，或者隔离重要的培养皿，并制备出复制品， 尤其对具有重要意义的杂交瘤细胞更应采取备份培养的方法。 细菌或真菌的污染可用肉眼或显微镜看到，而另一种更隐蔽的污染是支原体污染。支原 体是一种比病毒颗粒大、比细菌小的微生物，大小为0.22μm左右，约有1%可以通过0.22μm 滤菌器。常见的支原体主要来自人体及血清。支原体污染细胞后，培养基中除酚红指示剂显 示偏酸外，并不发生浑浊，细胞病理变化轻微，所以很难发现。用作融合亲代细胞的骨髓瘤 细胞在体外长期培养传代时，很容易受到这种难以察觉的污染，导致细胞增殖减缓。融合时， 杂交瘤的产生会受到明显影响，在融合后1周左右即可发现许多融合细胞突然崩解。由于支 原体污染是在不易观察的情况下发生的，其预防较为困难。良好的实验环境、良好的无菌操 作技术及优质的胎牛血清和试剂等仍然是很重要的环节。另外在引入新的细胞系时，应检测 细胞是否污染支原体，如果无支原体污染，细胞生长良好，应先培养冻存一批，以供备用。 用作融合的骨髓瘤细胞不宜长期在体外培养，一旦发现细胞生长变慢，支原体检查阳性，应 立即废弃。支原体不尉热，也可以在41C恒温培养讨夜，但这种方法需要了解细胞对热处 理的耐受程度。如果具有重要价值的杂交瘤细胞被支原体污染，不仅影响抗体的分泌特性， 而且也影响其应用。这时可采取的补救办法是将杂交瘤细胞或骨篇痴细胞接种于小鼠腹腕 内，利用机体的免疫系统来清除细胞的支原体。近年来采用BM-cycline等试剂处理被污染 的细胞获得相当良好的结果，而且操作方法也简便。 (二)小眼免疫 1.抗原 任何能引起免疫反应的物质都可以作为抗原。抗原在体内引起的兔疫反应与机体对抗原 的识别有关。抗原的初次免疫能使机体产生多价的低亲和力的gM。随着相同抗原的反复免 疫，机体产生抗体的反应加速，主要产生二价的gG。抗体的亲和力和血清中的滴度也随着 免疫次数的增多而增强。在杂交瘤的制备过程中，免疫的目的是使B细胞在抗原的刺激下 -54第四章 单克隆抗体 - 54 - 使整个工作由于污染而功亏一篑。因此，避免污染是组织培养实验工作中不可轻视的一环， 常见的微生物污染主要来自病毒、细菌、真菌及支原体。污染源主要来自于原代培养、血清、 实验室工作人员、污染的培养物及实验环境。避免污染的最好方法莫过于建立一个严格的实 验室管理制度和良好的无菌操作技术，这包括对任何引入新细胞系进行仔细的检测，对所有 的组织培养试剂在使用前都应作细菌及真菌检查。 细菌的污染可以用抗生素来控制，然而常规在培养体系中加人抗生素会导致耐药株的选 择性繁殖，从而有可能使实验环境处于耐药株的污染中。尽管如此，培养体系中仍然常规地 加入青霉素 100U/ml 和链霉素 100μg/ml。当有青、链霉素耐药株出现时，则可加入庆大霉 素（gentamycin）0.2mg/ml 或卡那霉素（kanamycin）500μg/ml，但这种处理的效果并不好。 真菌的污染是难以防范的。这主要是由于温热湿润的条件是霉菌生长的良好环境。定期 清洁有助于控制真菌的污染。虽然在培养中加入两性霉素 B（fungizone，ampholericin B， 5~10μg/ml）或制霉菌素（mycostatin，100μg/ml ）可以控制某些真菌的生长，然而一旦发 生真菌污染，往往也无能为力。这是因为真菌生长迅速，这两种抗生素的用量稍大也会影响 杂交瘤细胞的生长，所以当发现有真菌污染时最好的方法是将其销毁，也可以在有真菌的孔 中加入 lmol/L 氢氧化钠或 2mol/L 硫酸铜溶液，或者隔离重要的培养皿，并制备出复制品， 尤其对具有重要意义的杂交瘤细胞更应采取备份培养的方法。 细菌或真菌的污染可用肉眼或显微镜看到，而另一种更隐蔽的污染是支原体污染。支原 体是一种比病毒颗粒大、比细菌小的微生物，大小为 0.22μm 左右，约有 1％可以通过 0.22μm 滤菌器。常见的支原体主要来自人体及血清。支原体污染细胞后，培养基中除酚红指示剂显 示偏酸外，并不发生浑浊，细胞病理变化轻微，所以很难发现。用作融合亲代细胞的骨髓瘤 细胞在体外长期培养传代时，很容易受到这种难以察觉的污染，导致细胞增殖减缓。融合时， 杂交瘤的产生会受到明显影响，在融合后 1 周左右即可发现许多融合细胞突然崩解。由于支 原体污染是在不易观察的情况下发生的，其预防较为困难。良好的实验环境、良好的无菌操 作技术及优质的胎牛血清和试剂等仍然是很重要的环节。另外在引入新的细胞系时，应检测 细胞是否污染支原体，如果无支原体污染，细胞生长良好，应先培养冻存一批，以供备用。 用作融合的骨髓瘤细胞不宜长期在体外培养，一旦发现细胞生长变慢，支原体检查阳性，应 立即废弃。支原体不耐热，也可以在 41℃恒温培养过夜，但这种方法需要了解细胞对热处 理的耐受程度。如果具有重要价值的杂交瘤细胞被支原体污染，不仅影响抗体的分泌特性， 而且也影响其应用。这时可采取的补救办法是将杂交瘤细胞或骨髓瘤细胞接种于小鼠腹腔 内，利用机体的免疫系统来清除细胞的支原体。近年来采用 BM-cycline 等试剂处理被污染 的细胞获得相当良好的结果，而且操作方法也简便。 (二) 小鼠免疫 1． 抗原 任何能引起免疫反应的物质都可以作为抗原。抗原在体内引起的免疫反应与机体对抗原 的识别有关。抗原的初次免疫能使机体产生多价的低亲和力的 IgM。随着相同抗原的反复免 疫，机体产生抗体的反应加速，主要产生二价的 IgG。抗体的亲和力和血清中的滴度也随着 免疫次数的增多而增强。在杂交瘤的制备过程中，免疫的目的是使 B 细胞在抗原的刺激下