第四章单克隆杭体 分化、增殖，有利于细胞融合形成杂交瘤，尤其是增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的几率。 因此，免疫的效果是关系到能否获得特异性单抗的重要一环。 当需要免疫的抗原和动物确定之后，就应认真设计免疫方案，对抗原的质量、免疫途径、 次数、间隔及是否应用佐剂都应有一个总体考虑，甚至包括动物对抗原的免疫应答的检测都 应事先有所安排。 抗原的免疫包括体内免疫和体外免疫，本文主要叙述体内免疫的一些方法。为便于实验 操作，在动物的免疫过程中，我们常将抗原分为可溶性抗原和颗粒性抗原。前者如蛋白质、 碳水化合物或核酸等，后者如病毒、细菌和细胞等。一般颗粒性抗原都具有较强的免疫原性， 可以不加佐剂，而可溶性蛋白抗原在免疫时应添加佐剂。 用1g的可溶性蛋白抗原免疫小鼠，即可产生强烈的免疫反应。但一般在初次免疫中都 用10一20ug的抗原量。当有足够的抗原时，可以一次注射50ug。很少有一次超过200ug, 即使抗原不够纯时，总的注射量一般也不超过500ug。没有免疫原性的半抗原分子可与钥孔 成蓝蛋白或白蛋白等大分子蛋白偶合在一起，赋予其免疫原性。 颗粒性抗原由于能很快地被吞噬，所以是非常好的免疫原。利用可溶性抗原自身的多聚 效应可将其固相化在琼脂上而成为颗粒性抗原。由于重组DNA技术的进展，易于制备出重 组蛋白抗原。这些重组蛋白有极好的抗原性，在单抗的制备中十分有用。而且这些蛋白可以 纯化，以可溶性或固相化的形式进行免疫。 另一种免疫原是根据编码序列在体外合成多肽。当合成肽与牛血清蛋白或钥孔戚蓝蛋白 等载体蛋白交联后，即可成为强兔疫原。用多肽抗原免疫制备抗体的主要问题是所获抗体能 否与天然蛋白相结合。 活细胞也可以作为免疫原以制备针对细胞表面或内部抗原的单抗。在制备抗肿瘤细胞的 单克隆抗体时应尽可能保证肿瘤组织细胞的纯度。 核酸的抗原性很弱，通常是将其作为半抗原交联到载体蛋自上。分子量超过50000、大 而复杂的碳水化合物会引起中等程度的免疫反应，但重复免疫并不总能产生继发反应，大剂 量又会引起耐受，所以注射剂量应加以严格的控制。 2.动物选择 在开始设计免疫方案之前要选择合适的动物品系。应考虑动物的耐受性、可利用的抗原 数量及所制备抗体的特性（包括是否容易纯化）。一般选择6周龄的雌性BLB小鼠免疫。 因融合所用骨髓瘤细胞多来自该品系的小鼠，所获杂交瘤细胞可接种于BALB/c小鼠，制备 含抗体的腹水。当受检的免疫动物的血清中出现所需要的抗体时才开始做融合，如果抗血清 的效价较低，会增加获得理想单克隆抗体杂交瘤细胞的难度。 3.兔疫途径 兔疫的效果除决定于抗原的性质和宿主反应外，亦与兔疫途径有关。不同的抗原可经不 同的途径免疫。常用的免疫途径为皮下、腹腔、淋巴结及静脉，亦可经皮内或肌肉内注射。 为了增加抗原的免疫原性，可以将抗原交联到琼脂珠或聚丙烯酰胺等一些载体上，以利 吞噬细胞的吞噬。将蛋白抗原固相化到硝酸纤维膜上也可增加其免疫原性。也可将含有抗原 的硝酸纤维膜直接移植到小鼠皮下，或将含有抗原的硝酸纤维膜研碎之后悬浮于PBS中， 或用二甲基亚砜或丙酮溶解硝酸纤维膜之后，再悬浮于PBS或加入完全福氏佐剂乳化后进 -55 第四章 单克隆抗体 - 55 - 分化、增殖，有利于细胞融合形成杂交瘤，尤其是增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的几率。 因此，免疫的效果是关系到能否获得特异性单抗的重要一环。 当需要免疫的抗原和动物确定之后，就应认真设计免疫方案，对抗原的质量、免疫途径、 次数、间隔及是否应用佐剂都应有一个总体考虑，甚至包括动物对抗原的免疫应答的检测都 应事先有所安排。 抗原的免疫包括体内免疫和体外免疫，本文主要叙述体内免疫的一些方法。为便于实验 操作，在动物的免疫过程中，我们常将抗原分为可溶性抗原和颗粒性抗原。前者如蛋白质、 碳水化合物或核酸等，后者如病毒、细菌和细胞等。一般颗粒性抗原都具有较强的免疫原性， 可以不加佐剂，而可溶性蛋白抗原在免疫时应添加佐剂。 用 l μg 的可溶性蛋白抗原免疫小鼠，即可产生强烈的免疫反应。但一般在初次免疫中都 用 10～20μg 的抗原量。当有足够的抗原时，可以一次注射 50μg。很少有一次超过 200μg， 即使抗原不够纯时，总的注射量一般也不超过 500μg。没有免疫原性的半抗原分子可与钥孔 戚蓝蛋白或白蛋白等大分子蛋白偶合在一起，赋予其免疫原性。 颗粒性抗原由于能很快地被吞噬，所以是非常好的免疫原。利用可溶性抗原自身的多聚 效应可将其固相化在琼脂上而成为颗粒性抗原。由于重组 DNA 技术的进展，易于制备出重 组蛋白抗原。这些重组蛋白有极好的抗原性，在单抗的制备中十分有用。而且这些蛋白可以 纯化，以可溶性或固相化的形式进行免疫。 另一种免疫原是根据编码序列在体外合成多肽。当合成肽与牛血清蛋白或钥孔戚蓝蛋白 等载体蛋白交联后，即可成为强免疫原。用多肽抗原免疫制备抗体的主要问题是所获抗体能 否与天然蛋白相结合。 活细胞也可以作为免疫原以制备针对细胞表面或内部抗原的单抗。在制备抗肿瘤细胞的 单克隆抗体时应尽可能保证肿瘤组织细胞的纯度。 核酸的抗原性很弱，通常是将其作为半抗原交联到载体蛋白上。分子量超过 50000、大 而复杂的碳水化合物会引起中等程度的免疫反应，但重复免疫并不总能产生继发反应，大剂 量又会引起耐受，所以注射剂量应加以严格的控制。 2． 动物选择 在开始设计免疫方案之前要选择合适的动物品系。应考虑动物的耐受性、可利用的抗原 数量及所制备抗体的特性（包括是否容易纯化）。一般选择 6 周龄的雌性 BALB/c 小鼠免疫， 因融合所用骨髓瘤细胞多来自该品系的小鼠，所获杂交瘤细胞可接种于 BALB/c 小鼠，制备 含抗体的腹水。当受检的免疫动物的血清中出现所需要的抗体时才开始做融合，如果抗血清 的效价较低，会增加获得理想单克隆抗体杂交瘤细胞的难度。 3． 免疫途径 免疫的效果除决定于抗原的性质和宿主反应外，亦与免疫途径有关。不同的抗原可经不 同的途径免疫。常用的免疫途径为皮下、腹腔、淋巴结及静脉，亦可经皮内或肌肉内注射。 为了增加抗原的免疫原性，可以将抗原交联到琼脂珠或聚丙烯酰胺等一些载体上，以利 吞噬细胞的吞噬。将蛋白抗原固相化到硝酸纤维膜上也可增加其免疫原性。也可将含有抗原 的硝酸纤维膜直接移植到小鼠皮下，或将含有抗原的硝酸纤维膜研碎之后悬浮于 PBS 中， 或用二甲基亚砜或丙酮溶解硝酸纤维膜之后，再悬浮于 PBS 或加入完全福氏佐剂乳化后进