第四章单克隆杭保 行免疫。 皮下局部注射可以将可溶性或不溶性抗原注射到淋巴结引流区。一般皮下注射的总量不 超过1OO如l,而且皮下多点注射有利于增加免疫效果。皮下注射可以应用完全福氏佐剂，但 由于其可能的毒性，在制备及注射中要十分谨慎。 融合前一般都需要进行抗原冲击，静脉注射是最常用的途径。抗原经静脉进入血液循环 之后，讯谏被脾时、肝脏成肺中的后邀细南所吞磁、加工，从而产生强列的反应。但反应的 时间较短促。静脉注射一般不作为初次免疫的途径，尤其是不应作为大颗粒性抗原的免疫途 径，因为很可能引起血栓，损伤主要脏器，引起过敏反应，也容易诱发免疫耐受。在注射的 溶液中不应含有高浓度的变性剂或叠复钠一类有毒的防腐剂。 在进行次级免疫或抗原冲击时，理论上最好的方法是将这类抗原直接注射到淋巴样器官 中，如牌脏或足垫中。当抗原量少至纳克(g)时，用脾内免疫仍能获得良好的免疫效果。 微量抗原的脾内免疫较其他注入途径有更多的技术要求。打开麻醉的小鼠腹腔，用最小号的 注射针头经脾脏尾端刺入脾脏，将抗原悬液慢慢的注入脾内（约20如），轻轻压迫针孔待不 再渗出血液或液体时，即可缝合关闭腹腔。如果埋入吸附有抗原的硝酸纤维膜，则将约 2mm×3mm的三角形膜片经小切口插入到脾脏远端，将它埋植到脾脏组织中。脾脏可被重复 进行免疫。但使用微量抗原脾内免疫通常不会产生明显的血清抗体，所以即使没有明显的阳 性血清反应时，也可进行细胞融合。 4.截体 除了白蛋白、钥孔或蓝蛋白等大分子外，任何一种小的、情性的、无毒性、能固定抗原 并可使抗原缓慢释放的物质都可作为载体。抗原与载体的结合可以是特异性的或非特异性 的。载体的选择取决于抗原的种类，在交联或其它操作过程中应避免抗原构型改变而失活。 常用的载体可分为珠体和膜两类，珠体能与配基如蛋白A或G共价交联，而配基与免 疫原可有特异的亲和力。连接暴露的氨基、羟基、羟基、或巯基的衍生物珠体可制成珠体 配基抗原复合物。 脂质体是由磷脂化合物构成的多层囊泡，各种免疫原可包裹嵌在脂质体的多层膜间。由 于它在体内能被巨噬细胞迅速吞噬，在细胞内被缓慢地逐步释放，因而具有较强的增强免疫 原性的作用。硝酸纤维膜、尼龙膜和阳离子尼龙膜也可以分别与亲水性蛋白质、疏水物质、 以及寡核苷酸、DNA和RNA结合，可以直接将抗原滴于膜上，亦可在电泳后印迹转移到膜 上，取抗原区带用于免疫。 二、细胞融合 细胞融合是杂交瘤产生的中心环节，这一步关系到全部工作的成败。操作的全部过程沙 须在严格无菌的条件下进行。细胞融合要准备两种细胞，骨髓瘤细胞和脾细胞。 (一)主要试剂 1.培养基 完全RPM-1640(含20%FCS)或完全DMEM培养基（含20%FCS,20 nmol/LHEPES -56-第四章 单克隆抗体 - 56 - 行免疫。 皮下局部注射可以将可溶性或不溶性抗原注射到淋巴结引流区。一般皮下注射的总量不 超过 100μl，而且皮下多点注射有利于增加免疫效果。皮下注射可以应用完全福氏佐剂，但 由于其可能的毒性，在制备及注射中要十分谨慎。 融合前一般都需要进行抗原冲击，静脉注射是最常用的途径。抗原经静脉进入血液循环 之后，迅速被脾脏、肝脏或肺中的巨噬细胞所吞噬、加工，从而产生强烈的反应。但反应的 时间较短促。静脉注射一般不作为初次免疫的途径，尤其是不应作为大颗粒性抗原的免疫途 径，因为很可能引起血栓，损伤主要脏器，引起过敏反应，也容易诱发免疫耐受。在注射的 溶液中不应含有高浓度的变性剂或叠氮钠一类有毒的防腐剂。 在进行次级免疫或抗原冲击时，理论上最好的方法是将这类抗原直接注射到淋巴样器官 中，如脾脏或足垫中。当抗原量少至纳克（ng）时，用脾内免疫仍能获得良好的免疫效果。 微量抗原的脾内免疫较其他注入途径有更多的技术要求。打开麻醉的小鼠腹腔，用最小号的 注射针头经脾脏尾端刺入脾脏，将抗原悬液慢慢的注入脾内（约 20μl），轻轻压迫针孔待不 再渗出血液或液体时，即可缝合关闭腹腔。如果埋入吸附有抗原的硝酸纤维膜，则将约 2mm×3mm 的三角形膜片经小切口插入到脾脏远端，将它埋植到脾脏组织中。脾脏可被重复 进行免疫。但使用微量抗原脾内免疫通常不会产生明显的血清抗体，所以即使没有明显的阳 性血清反应时，也可进行细胞融合。 4． 载体 除了白蛋白、钥孔戚蓝蛋白等大分子外，任何一种小的、惰性的、无毒性、能固定抗原 并可使抗原缓慢释放的物质都可作为载体。抗原与载体的结合可以是特异性的或非特异性 的。载体的选择取决于抗原的种类，在交联或其它操作过程中应避免抗原构型改变而失活。 常用的载体可分为珠体和膜两类，珠体能与配基如蛋白 A 或 G 共价交联，而配基与免 疫原可有特异的亲和力。连接暴露的氨基、羟基、羟基、或巯基的衍生物珠体可制成珠体- 配基-抗原复合物。 脂质体是由磷脂化合物构成的多层囊泡，各种免疫原可包裹嵌在脂质体的多层膜间。由 于它在体内能被巨噬细胞迅速吞噬，在细胞内被缓慢地逐步释放，因而具有较强的增强免疫 原性的作用。硝酸纤维膜、尼龙膜和阳离子尼龙膜也可以分别与亲水性蛋白质、疏水物质、 以及寡核苷酸、DNA 和 RNA 结合，可以直接将抗原滴于膜上，亦可在电泳后印迹转移到膜 上，取抗原区带用于免疫。 二、细胞融合 细胞融合是杂交瘤产生的中心环节，这一步关系到全部工作的成败。操作的全部过程必 须在严格无菌的条件下进行。细胞融合要准备两种细胞，骨髓瘤细胞和脾细胞。 (一) 主要试剂 1. 培养基 完全 RPMI-1640（含 20％FCS）或完全 DMEM 培养基（含 20％FCS，20mmol/L HEPES