七、PAGE 原理： 2、 PAGE 电泳的试剂，溶液的功能。 CH2=CH —CH2—CH—[CH2—CH]x— ︳ ︳ ︳ C=O CH2 CO C=O ︳ ∣ ︳ ︳ NH CH NH NH2 ︳ ︱ ︳ CH2 ＋ C=O CH2 ︳ ︳ ︳ NH NH2 NH ︳ ︳ C=O CO ︳ ︳ CH2=CH —CH2—CH—[CH2—CH]x— ︳ C=O ︳ NH2 甲叉双丙烯酰胺 丙烯酰胺 网状聚合物 催化剂：过硫酸铵，AP，在隔氧的状态下。 加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。 催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。 PH8.3 的电泳缓冲液：6g 的 Tris+28.8g 甘氨酸→10000ml 水中。电泳时使 Cl¯，—Coo¯ 离子带动蛋白质在网状聚合物中移动。 PH6.7 的 Tris–HCl buffer，电泳时使蛋白质解离带电荷。 PH8.9 的 Tris–HCl buffer，电泳时使蛋白质解离带电荷。 溴酚兰 电泳指示剂，一般迁移在蛋白质之前。 R–250 考马斯亮兰，蛋白质染色剂，在一个组分中含量达 1ug 时呈可见带。 2．电泳管、板的制作： a． 管垂直插入橡胶头内，距上端 1cm，2cm 处用蜡笔标记出。 b． 板用凡士林或硅胶橡胶套密封并夹入电泳槽中，直立，同上标出记号。 （橡胶套密封后要用琼脂糖或琼脂密封，使成为一个长方形小室，不漏） 3．灌胶： 先灌分离胶：20ml，7.5%分离胶，需分离胶 buff 2.5ml，胶贮液 5ml，10%TEMED 0.1ml， 混匀，用长头滴管加至第一个标记处，用蒸馏水复盖。可见一条明显折射线， 以后模糊，再清晰，表明聚合完全。去水（用长条滤纸）。 后灌浓缩胶：10ml，30%胶浓度，需浓缩胶buff 1.25ml，胶贮液1.0ml，10%TEMED 0.05ml， H2O 7.65ml，10%AP 0.05ml，用长头滴管加至管的第二记号处或平板的满槽， 平板加满后马上插入梳子令其聚合（约 30min）。管状的加入水令其凝固。 4．上样，见讲义。 5．上样，见讲义。七、PAGE 原理： 2、 PAGE 电泳的试剂，溶液的功能。 CH2=CH —CH2—CH—[CH2—CH]x— ︳ ︳ ︳ C=O CH2 CO C=O ︳ ∣ ︳ ︳ NH CH NH NH2 ︳ ︱ ︳ CH2 ＋ C=O CH2 ︳ ︳ ︳ NH NH2 NH ︳ ︳ C=O CO ︳ ︳ CH2=CH —CH2—CH—[CH2—CH]x— ︳ C=O ︳ NH2 甲叉双丙烯酰胺 丙烯酰胺 网状聚合物 催化剂：过硫酸铵，AP，在隔氧的状态下。 加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。 催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。 PH8.3 的电泳缓冲液：6g 的 Tris+28.8g 甘氨酸→10000ml 水中。电泳时使 Cl¯，—Coo¯ 离子带动蛋白质在网状聚合物中移动。 PH6.7 的 Tris–HCl buffer，电泳时使蛋白质解离带电荷。 PH8.9 的 Tris–HCl buffer，电泳时使蛋白质解离带电荷。 溴酚兰 电泳指示剂，一般迁移在蛋白质之前。 R–250 考马斯亮兰，蛋白质染色剂，在一个组分中含量达 1ug 时呈可见带。 2．电泳管、板的制作： a． 管垂直插入橡胶头内，距上端 1cm，2cm 处用蜡笔标记出。 b． 板用凡士林或硅胶橡胶套密封并夹入电泳槽中，直立，同上标出记号。 （橡胶套密封后要用琼脂糖或琼脂密封，使成为一个长方形小室，不漏） 3．灌胶： 先灌分离胶：20ml，7.5%分离胶，需分离胶 buff 2.5ml，胶贮液 5ml，10%TEMED 0.1ml， 混匀，用长头滴管加至第一个标记处，用蒸馏水复盖。可见一条明显折射线， 以后模糊，再清晰，表明聚合完全。去水（用长条滤纸）。 后灌浓缩胶：10ml，30%胶浓度，需浓缩胶buff 1.25ml，胶贮液1.0ml，10%TEMED 0.05ml， H2O 7.65ml，10%AP 0.05ml，用长头滴管加至管的第二记号处或平板的满槽， 平板加满后马上插入梳子令其聚合（约 30min）。管状的加入水令其凝固。 4．上样，见讲义。 5．上样，见讲义