19 浙江大学 遗传学第十二章 109 2. 构建物理图谱的三条途径： ⑴. 限制性酶图谱： 利用限制性内切酶绘制图谱，对于DNA分子长度小于 50kb的片段，一般没有困难。而对于>50kb的DNA分子， 可选用稀有切点内切酶 酶切DNA。 浙江大学 遗传学第十二章 110 € 用识别位点较多核苷酸的内切酶： 如Not I，为8个核苷酸出现的频率为1/48=1/65536bp； 而识别位点为6个核苷酸的出现频率为1/46=1/4094bp。 € 选用其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶 ： 人类基因组中，5’-CG-3’出现的频率很低： Sma I (5’-CCCGGG-3’)酶切DNA，每78kb有一个切点； BssH II (5’-GCGCGC-3’)酶切DNA，每390 kb有一个切点； Not I (5’-GCGGCCGC-3’)酶切DNA，每10 Mb只有一个 酶切点。 浙江大学 遗传学第十二章 111 ⑵. 荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH) ： 另一种物理图谱构建方法：荧光标记的探针与DNA分子 杂交 Î染色体上杂交信号（即探针DNA在染色体上的图谱位 点）在显微镜下可直接观察。 步骤：取有丝分裂中期的细胞制片 Î 将染色体变性成 单链 Î 将标记DNA探针变性 后杂交到染色体上Î观察分析。 应用多色荧光原位杂交技术 将10个BAC探针定位于水稻的 第10号染色体的长臂上 (引自Cheng等，Genetics, 2001) 浙江大学 遗传学第十二章 112 ⑶. 序列标签位点： 已知序列为标签的位点（sequence tagged sites， STS） 作探针，与基因组DNA杂交Î绘制物理图谱。 STS的要求： €为已知序列，便于PCR检测； €基因组中仅此一个位点，无重复。 常用的两大类型STS： ①. 特异DNA序列： €表达的序列标签(expressed sequence tag，EST)，表达的 序列来自cDNA。 €简单序列长度多态性(SSLP)也可用于物理图谱的构建， 比较遗传图谱和物理图谱。 €DNA随机片段，测序后经分析比较，非重复序列可作 为STS。 ②.DNA片段： 分为两种不同类型： €辐射杂交系(radiation hybrid) ：指啮齿动物细胞含有另 一个生物染色体片段的细胞株。 浙江大学 遗传学第十二章 114 细胞遗传学研究表明： 用3000~8000radX射线处理后 Î人类染色体会出现随机断裂 Î 将处理细胞与正常仓鼠或其它啮齿 动物细胞融合 Î断裂的人类染色体 可与仓鼠染色体融合Î复制Î利用 100个人类基因组辐射后与缺失仓鼠 细胞融合形成的辐射杂交系（能在 HAT培养基上生长的就是含有人类 染色体片断的细胞Î进行人类基因组物理图谱的构建。19 浙江大学 遗传学第十二章 109 2. 构建物理图谱的三条途径： ⑴. 限制性酶图谱： 利用限制性内切酶绘制图谱，对于DNA分子长度小于 50kb的片段，一般没有困难。而对于>50kb的DNA分子， 可选用稀有切点内切酶 酶切DNA。 浙江大学 遗传学第十二章 110 € 用识别位点较多核苷酸的内切酶： 如Not I，为8个核苷酸出现的频率为1/48=1/65536bp； 而识别位点为6个核苷酸的出现频率为1/46=1/4094bp。 € 选用其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶 ： 人类基因组中，5’-CG-3’出现的频率很低： Sma I (5’-CCCGGG-3’)酶切DNA，每78kb有一个切点； BssH II (5’-GCGCGC-3’)酶切DNA，每390 kb有一个切点； Not I (5’-GCGGCCGC-3’)酶切DNA，每10 Mb只有一个 酶切点。 浙江大学 遗传学第十二章 111 ⑵. 荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH) ： 另一种物理图谱构建方法：荧光标记的探针与DNA分子 杂交 Î染色体上杂交信号（即探针DNA在染色体上的图谱位 点）在显微镜下可直接观察。 步骤：取有丝分裂中期的细胞制片 Î 将染色体变性成 单链 Î 将标记DNA探针变性 后杂交到染色体上Î观察分析。 应用多色荧光原位杂交技术 将10个BAC探针定位于水稻的 第10号染色体的长臂上 (引自Cheng等，Genetics, 2001) 浙江大学 遗传学第十二章 112 ⑶. 序列标签位点： 已知序列为标签的位点（sequence tagged sites， STS） 作探针，与基因组DNA杂交Î绘制物理图谱。 STS的要求： €为已知序列，便于PCR检测； €基因组中仅此一个位点，无重复。 常用的两大类型STS： ①. 特异DNA序列： €表达的序列标签(expressed sequence tag，EST)，表达的 序列来自cDNA。 €简单序列长度多态性(SSLP)也可用于物理图谱的构建， 比较遗传图谱和物理图谱。 €DNA随机片段，测序后经分析比较，非重复序列可作 为STS。 ②.DNA片段： 分为两种不同类型： €辐射杂交系(radiation hybrid) ：指啮齿动物细胞含有另 一个生物染色体片段的细胞株。 浙江大学 遗传学第十二章 114 细胞遗传学研究表明： 用3000~8000radX射线处理后 Î人类染色体会出现随机断裂 Î 将处理细胞与正常仓鼠或其它啮齿 动物细胞融合 Î断裂的人类染色体 可与仓鼠染色体融合Î复制Î利用 100个人类基因组辐射后与缺失仓鼠 细胞融合形成的辐射杂交系（能在 HAT培养基上生长的就是含有人类 染色体片断的细胞Î进行人类基因组物理图谱的构建