1 浙江大学 遗传学第十二章 1 转基因烟草 来自荧火虫的荧光素酶 第十二章 基因工程和基因组学 浙江大学 遗传学第十二章 2 1．基因工程和基因组学的概念和应用； 2．内切酶的类别和作用； 3．重组DNA； 4．基因的分离和鉴定； 5．基因组图谱的构建和应用； 6．后基因组学。 本章重点 浙江大学 遗传学第十二章 3 果蝇转基因 β –半乳糖苷酶 第一节 基因工程 浙江大学 遗传学第十二章 4 广义遗传工程包括: 生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、 细胞器工程、基因工程及酶工程等。 狭义遗传工程是指: 基因工程(重组DNA技术)。 一、基因工程概述: 一、基因工程概述: 浙江大学 遗传学第十二章 5 １.概念： 基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式 Î 按照 预先设计的蓝图 Î 借助于实验室技术将某种生物的基因或 基因组转移到另一生物中去 Î 使后者定向获得新遗传性状 的一门技术。 基因工程技术的建立，使实验生物学领域产生巨大变革。 浙江大学 遗传学第十二章 6 2. 发展： 1971年 史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种 限制性酶 Î 酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组 时代的开始。 1972年 伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和 λ噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来 ¨ 得到新的DNA分子。 1973年 科恩（Cohen S.）等进一 步将酶切DNA分子与质粒 DNA连接起来，并将重组 质粒转入E. cloi细胞中
1 浙江大学 遗传学第十二章 1 转基因烟草 来自荧火虫的荧光素酶 第十二章 基因工程和基因组学 浙江大学 遗传学第十二章 2 1．基因工程和基因组学的概念和应用； 2．内切酶的类别和作用； 3．重组DNA； 4．基因的分离和鉴定； 5．基因组图谱的构建和应用； 6．后基因组学。 本章重点 浙江大学 遗传学第十二章 3 果蝇转基因 β –半乳糖苷酶 第一节 基因工程 浙江大学 遗传学第十二章 4 广义遗传工程包括: 生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、 细胞器工程、基因工程及酶工程等。 狭义遗传工程是指: 基因工程(重组DNA技术)。 一、基因工程概述: 一、基因工程概述: 浙江大学 遗传学第十二章 5 １.概念： 基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式 Î 按照 预先设计的蓝图 Î 借助于实验室技术将某种生物的基因或 基因组转移到另一生物中去 Î 使后者定向获得新遗传性状 的一门技术。 基因工程技术的建立，使实验生物学领域产生巨大变革。 浙江大学 遗传学第十二章 6 2. 发展： 1971年 史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种 限制性酶 Î 酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组 时代的开始。 1972年 伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和 λ噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来 ¨ 得到新的DNA分子。 1973年 科恩（Cohen S.）等进一 步将酶切DNA分子与质粒 DNA连接起来，并将重组 质粒转入E. cloi细胞中
2 浙江大学 遗传学第十二章 7 1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在 细菌中生产人的胰岛素投放市场。 1985年，转基因植物获得成功。 1986年，穆勒斯发明了PCR技术，专利转让达3亿美元。 1990 年9月14日是基因治疗的诞生日。 在美国马里兰州的一个医疗中心进行第一例基因 治疗临床试验。一个4岁的小女孩戴斯瓦(A. DeSilva)，患有严重综合免疫缺失症（SCID）。 将腺苷酸脱氨酶（ADA）基因转入骨髓细胞，再 送回病人体内，基因治疗SCID获得初步效果。 浙江大学 遗传学第十二章 8 1994年，延熟保鲜的转基因番茄 商品生产。 1996年，威尔穆特研究小组克隆羊“多莉”诞 生（利用6岁成年母羊乳腺细胞）。 1997年，威尔穆特小组报道用胎 儿细胞为核供体，获得 了表达治疗人血友病的 凝血因子IX转基因克隆 羊“波莉” 浙江大学 遗传学第十二章 9 1998年，美国夏威夷大学用一只实验鼠 的细胞克隆了3代共50只实验鼠。 2000年，美国用无性繁殖技术克隆猴子 “泰特拉”，意味克隆人体已无 技术障碍。 2001年，美国宣布首次克隆成功处于早 期阶段的人体胚胎。 2002年，12 月法国研究者宣布克隆出第 一个女婴，但一直未获得证实。 浙江大学 遗传学第十二章 10 1996年全世界转基因植物种植面积为170万公顷，1997年为 1100万公顷，1998年2780万公顷，1999年3990万公顷，2000年 4420万公顷，2001年5260万公顷，2002年5000万公顷。 170 1100 2780 3990 4420 5260 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 1234567 年份 面积（万公顷） 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 浙江大学 遗传学第十二章 11 2001年种植面积>100万公顷的转基因作物： 大豆（3330万hm2， 占全世界转基因作物的63%， 均为 抗除草剂大豆）、玉米（980万hm2 ，占19% ）、棉花（680 万hm2 ，占13% ）、油菜（270万hm2 ，占5% ）； 其它还有水稻、 小麦、 花生、 向日葵、 亚麻、 甘蓝、 马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等50多种转基因作物已 培育成功。 主要分布在美国（3570万hm2）、阿根廷（1180万hm2）、 加拿大（320万hm2）和中国（150万hm2）等国。 浙江大学 遗传学第十二章 12 2001年全世界转基因作物占相应作物种植总面积的比较 27100 7200 3400 2500 14000 5265 3330 680 275 980 总 大豆 棉花 油菜 玉米 面积（万公顷） 总面积 转基因
2 浙江大学 遗传学第十二章 7 1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在 细菌中生产人的胰岛素投放市场。 1985年，转基因植物获得成功。 1986年，穆勒斯发明了PCR技术，专利转让达3亿美元。 1990 年9月14日是基因治疗的诞生日。 在美国马里兰州的一个医疗中心进行第一例基因 治疗临床试验。一个4岁的小女孩戴斯瓦(A. DeSilva)，患有严重综合免疫缺失症（SCID）。 将腺苷酸脱氨酶（ADA）基因转入骨髓细胞，再 送回病人体内，基因治疗SCID获得初步效果。 浙江大学 遗传学第十二章 8 1994年，延熟保鲜的转基因番茄 商品生产。 1996年，威尔穆特研究小组克隆羊“多莉”诞 生（利用6岁成年母羊乳腺细胞）。 1997年，威尔穆特小组报道用胎 儿细胞为核供体，获得 了表达治疗人血友病的 凝血因子IX转基因克隆 羊“波莉” 浙江大学 遗传学第十二章 9 1998年，美国夏威夷大学用一只实验鼠 的细胞克隆了3代共50只实验鼠。 2000年，美国用无性繁殖技术克隆猴子 “泰特拉”，意味克隆人体已无 技术障碍。 2001年，美国宣布首次克隆成功处于早 期阶段的人体胚胎。 2002年，12 月法国研究者宣布克隆出第 一个女婴，但一直未获得证实。 浙江大学 遗传学第十二章 10 1996年全世界转基因植物种植面积为170万公顷，1997年为 1100万公顷，1998年2780万公顷，1999年3990万公顷，2000年 4420万公顷，2001年5260万公顷，2002年5000万公顷。 170 1100 2780 3990 4420 5260 5000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 1234567 年份 面积（万公顷） 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 浙江大学 遗传学第十二章 11 2001年种植面积>100万公顷的转基因作物： 大豆（3330万hm2， 占全世界转基因作物的63%， 均为 抗除草剂大豆）、玉米（980万hm2 ，占19% ）、棉花（680 万hm2 ，占13% ）、油菜（270万hm2 ，占5% ）； 其它还有水稻、 小麦、 花生、 向日葵、 亚麻、 甘蓝、 马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等50多种转基因作物已 培育成功。 主要分布在美国（3570万hm2）、阿根廷（1180万hm2）、 加拿大（320万hm2）和中国（150万hm2）等国。 浙江大学 遗传学第十二章 12 2001年全世界转基因作物占相应作物种植总面积的比较 27100 7200 3400 2500 14000 5265 3330 680 275 980 总 大豆 棉花 油菜 玉米 面积（万公顷） 总面积 转基因
3 浙江大学 遗传学第十二章 13 2001年我国的转基因农作物和林木已达22种，其中 转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、 甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模 商品化生产。 浙江大学 遗传学第十二章 14 3．内容： ①．从细胞和组织中分离DNA； ②．限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段； ③．将酶切DNA分子与载体DNA连接 Î 构建能在宿主细胞内 自我复制的重组DNA分子； ④．把重组DNA分子引入宿主受体细胞 Î 复制； ⑤．重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞 Î 建立无性 繁殖系(clone)或发育成个体； ⑥．从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系 Î 并使外源基因 在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收； 或筛选出获得定向性状变异的个体。 浙江大学 遗传学第十二章 15 1. 限制性内切酶(restriction enzyme)： 一种水解DNA的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。 细菌细胞中存在限制修饰系统： 限制：降解外源DNA，防御异源遗传信息进入的手段。 修饰：修饰外源DNA片段后，保留在新细胞中。 二、 限制性内切核酸酶： 二、 限制性内切核酸酶： 浙江大学 遗传学第十二章 16 限制性内切酶如：EcoR I、Hind III： 酶切方式： 以交错方式切断 DNA双链，产生二个 相同单链粘性末端。 重组过程： 两种片段在适宜 条件下，可经磷酸二 脂链，连接成重组 DNA分子。 浙江大学 遗传学第十二章 17 ⑵．限制性内切酶的类别： 第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）： 如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大 (约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子。 第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）： 如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌)，分子量较小(约 20000~100000)，作用时需Mg++存在。 ⑴．限制性内切酶的命名： 根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示； ①. EcoR I 来自大肠杆菌（Escherichia coli）； ②. Hind Ⅲ来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。 浙江大学 遗传学第十二章 18 第Ⅱ类酶特点： ♣ 切割产生平齐末端（blunt ends），如Sma I：
3 浙江大学 遗传学第十二章 13 2001年我国的转基因农作物和林木已达22种，其中 转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、 甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模 商品化生产。 浙江大学 遗传学第十二章 14 3．内容： ①．从细胞和组织中分离DNA； ②．限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段； ③．将酶切DNA分子与载体DNA连接 Î 构建能在宿主细胞内 自我复制的重组DNA分子； ④．把重组DNA分子引入宿主受体细胞 Î 复制； ⑤．重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞 Î 建立无性 繁殖系(clone)或发育成个体； ⑥．从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系 Î 并使外源基因 在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收； 或筛选出获得定向性状变异的个体。 浙江大学 遗传学第十二章 15 1. 限制性内切酶(restriction enzyme)： 一种水解DNA的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。 细菌细胞中存在限制修饰系统： 限制：降解外源DNA，防御异源遗传信息进入的手段。 修饰：修饰外源DNA片段后，保留在新细胞中。 二、 限制性内切核酸酶： 二、 限制性内切核酸酶： 浙江大学 遗传学第十二章 16 限制性内切酶如：EcoR I、Hind III： 酶切方式： 以交错方式切断 DNA双链，产生二个 相同单链粘性末端。 重组过程： 两种片段在适宜 条件下，可经磷酸二 脂链，连接成重组 DNA分子。 浙江大学 遗传学第十二章 17 ⑵．限制性内切酶的类别： 第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）： 如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大 (约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子。 第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）： 如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌)，分子量较小(约 20000~100000)，作用时需Mg++存在。 ⑴．限制性内切酶的命名： 根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示； ①. EcoR I 来自大肠杆菌（Escherichia coli）； ②. Hind Ⅲ来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。 浙江大学 遗传学第十二章 18 第Ⅱ类酶特点： ♣ 切割产生平齐末端（blunt ends），如Sma I：
4 浙江大学 遗传学第十二章 19 ♣ 有的产生粘性末端（sticky ends），如BamH I、 Pst I ： }识别特定碱基顺序，如回文对称序列（palindrome，又称 反向重复序列，从两个方向阅读其序列相同的序列）。 浙江大学 遗传学第十二章 20 部 分 常 用 的 限 制 性 内 切 酶 浙江大学 遗传学第十二章 21 运载工具：将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。 DNA片段 ¬ 适合的载体DNA ¨ 重组DNA ¨ 在 载体DNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在 其中进行复制。 DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母 菌人工染色体等。 三、载体（ 三、载体（vector vector）：）： 浙江大学 遗传学第十二章 22 载体的条件： ①.具有复制原点，能自我复制； ②.具多克隆位点 (multiple cloning site，MCS 或polylinker region)， 即有多种限制酶的切点； ③.选择时的遗传标记，如抗生素 基因； ④.易从宿主细胞中回收。 pUC19质粒 浙江大学 遗传学第十二章 23 ㈠、细菌质粒： 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、 能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。 质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA 片段。 在细胞内的复制程度： 严紧型：一个细菌细胞内质粒数量有1~2个； 松驰型：每个细胞内有的20~60个。 浙江大学 遗传学第十二章 24 如pUC18质粒具有以下特点： ①. 分子量小，可接受较大外源片段； ②. 拷贝数多，500个／细胞； ③. 克隆位点的酶切位点多，克隆 方便； ④. 具有用于检测重组质粒的选择 标记（α–互补的显色表型）
4 浙江大学 遗传学第十二章 19 ♣ 有的产生粘性末端（sticky ends），如BamH I、 Pst I ： }识别特定碱基顺序，如回文对称序列（palindrome，又称 反向重复序列，从两个方向阅读其序列相同的序列）。 浙江大学 遗传学第十二章 20 部 分 常 用 的 限 制 性 内 切 酶 浙江大学 遗传学第十二章 21 运载工具：将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。 DNA片段 ¬ 适合的载体DNA ¨ 重组DNA ¨ 在 载体DNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在 其中进行复制。 DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母 菌人工染色体等。 三、载体（ 三、载体（vector vector）：）： 浙江大学 遗传学第十二章 22 载体的条件： ①.具有复制原点，能自我复制； ②.具多克隆位点 (multiple cloning site，MCS 或polylinker region)， 即有多种限制酶的切点； ③.选择时的遗传标记，如抗生素 基因； ④.易从宿主细胞中回收。 pUC19质粒 浙江大学 遗传学第十二章 23 ㈠、细菌质粒： 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、 能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。 质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA 片段。 在细胞内的复制程度： 严紧型：一个细菌细胞内质粒数量有1~2个； 松驰型：每个细胞内有的20~60个。 浙江大学 遗传学第十二章 24 如pUC18质粒具有以下特点： ①. 分子量小，可接受较大外源片段； ②. 拷贝数多，500个／细胞； ③. 克隆位点的酶切位点多，克隆 方便； ④. 具有用于检测重组质粒的选择 标记（α–互补的显色表型）
5 浙江大学 遗传学第十二章 25 ㈡、λ噬菌体（温和型）： 基因组全长为49kb。 噬菌体DNA中间约2/3的序列 为中间基因簇，两端为DNA左、 右臂。中间基因簇可被外源DNA 替代而不影响侵染细菌能力。 能接受15kb外源DNA片段¨ 作为cDNA或核DNA克隆载体。 优点： ♣不易引起生物危害，有助于 “目的”基因进入细胞并增殖； ♣携带大片段外源DNA分子， 占总量25%时仍不失活。 浙江大学 遗传学第十二章 26 ㈢、柯斯质粒(cosmid)： 噬菌体DNA 部分细菌质粒DNA序列 ¨ 柯斯质粒。 有噬菌体cos序列、细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。 这种质粒分子量较小， 但可接受长达50kb的外源 DNA片段¨克隆真核生物 基因。 ∵一个长片段DNA可能 具有真核生物基因的编码 序列及其它调控序列。 浙江大学 遗传学第十二章 27 指能在两种不同生物中复制的载体。 如能在原核生物(如E. coli)、真核细胞(如酵母)中复制的载体。 穿梭载体需具有细菌质粒复制原点、真核生物自主复制序列 (Auto-nomously replicating sequence, ARS)以及两者的选择标记。 穿梭载体在细菌中用于克隆、 扩增基因，在酵母重用与基因表达 分析。 酵母菌的YEp (yeast episoma plasmid)等系列载体均是穿梭载体。 ㈣、穿梭载体（shuttle vectors）： 浙江大学 遗传学第十二章 28 ㈤、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)： BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子 改造成BAC载体，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。 特点： 带有外源DNA的BAC载体在 细胞中是单拷贝的； 载体分子量很小(7.4kb)； 选择标记：氯霉素抗性基因； 多克隆位点。 浙江大学 遗传学第十二章 29 ㈥、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)： 1996年完成了酵母菌 全基因组序列的测定。 YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌 中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受 100~1000kb的外源DNA片段。 YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具； 并促进了人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC) 的研究。 浙江大学 遗传学第十二章 30 pYAC4特点： 1. 两个可在酵母菌中利用的选择基因， URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； 2. 酵母菌着丝粒序列(CEN4)； 3. 一个自主复制序列(ARS1)； 4. 两个嗜热四膜虫末端重复序列(TEL) ¨保持重组YAC为线状结构； 5. 在两个末端序列中间，有一段填充 序列(His3)¨使pYAC4在细菌细胞中 能稳定扩增； 6. Amp抗性及细菌质粒复制原点； 7. 一个EcoR I 克隆位点，位于酵母菌 Sup4 tRNA基因内。 酵母菌人工染色体pYAC4 在克隆外源DNA时，用Bam HI 和EcoR I双酶切，得到二个人工 染色体臂，与EcoR I 酶切的外源 DNA 片段连接，构成重组的酵母 人工染色体，用于转化酵母菌
5 浙江大学 遗传学第十二章 25 ㈡、λ噬菌体（温和型）： 基因组全长为49kb。 噬菌体DNA中间约2/3的序列 为中间基因簇，两端为DNA左、 右臂。中间基因簇可被外源DNA 替代而不影响侵染细菌能力。 能接受15kb外源DNA片段¨ 作为cDNA或核DNA克隆载体。 优点： ♣不易引起生物危害，有助于 “目的”基因进入细胞并增殖； ♣携带大片段外源DNA分子， 占总量25%时仍不失活。 浙江大学 遗传学第十二章 26 ㈢、柯斯质粒(cosmid)： 噬菌体DNA 部分细菌质粒DNA序列 ¨ 柯斯质粒。 有噬菌体cos序列、细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。 这种质粒分子量较小， 但可接受长达50kb的外源 DNA片段¨克隆真核生物 基因。 ∵一个长片段DNA可能 具有真核生物基因的编码 序列及其它调控序列。 浙江大学 遗传学第十二章 27 指能在两种不同生物中复制的载体。 如能在原核生物(如E. coli)、真核细胞(如酵母)中复制的载体。 穿梭载体需具有细菌质粒复制原点、真核生物自主复制序列 (Auto-nomously replicating sequence, ARS)以及两者的选择标记。 穿梭载体在细菌中用于克隆、 扩增基因，在酵母重用与基因表达 分析。 酵母菌的YEp (yeast episoma plasmid)等系列载体均是穿梭载体。 ㈣、穿梭载体（shuttle vectors）： 浙江大学 遗传学第十二章 28 ㈤、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)： BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子 改造成BAC载体，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。 特点： 带有外源DNA的BAC载体在 细胞中是单拷贝的； 载体分子量很小(7.4kb)； 选择标记：氯霉素抗性基因； 多克隆位点。 浙江大学 遗传学第十二章 29 ㈥、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)： 1996年完成了酵母菌 全基因组序列的测定。 YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌 中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受 100~1000kb的外源DNA片段。 YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具； 并促进了人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC) 的研究。 浙江大学 遗传学第十二章 30 pYAC4特点： 1. 两个可在酵母菌中利用的选择基因， URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； 2. 酵母菌着丝粒序列(CEN4)； 3. 一个自主复制序列(ARS1)； 4. 两个嗜热四膜虫末端重复序列(TEL) ¨保持重组YAC为线状结构； 5. 在两个末端序列中间，有一段填充 序列(His3)¨使pYAC4在细菌细胞中 能稳定扩增； 6. Amp抗性及细菌质粒复制原点； 7. 一个EcoR I 克隆位点，位于酵母菌 Sup4 tRNA基因内。 酵母菌人工染色体pYAC4 在克隆外源DNA时，用Bam HI 和EcoR I双酶切，得到二个人工 染色体臂，与EcoR I 酶切的外源 DNA 片段连接，构成重组的酵母 人工染色体，用于转化酵母菌
6 浙江大学 遗传学第十二章 31 农杆菌 感染产生 冠瘿瘤 ㈦、Ti质粒及其衍生载体： 适合于植物的载体系统¨将重组DNA运载到植物细胞中¨ 目的基因表达。 Ti质粒(细菌质粒)：自然存在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，革兰氏阴菌)细胞¨可诱导植物产生瘤细胞(tumorinducing, Ti) ¨冠瘿瘤(grown galltumors)。 Ti质粒有一部分转移DNA (transfer DNA，T-DNA)¨当农杆菌感染植物时， T-DNA便转移到植物染色体上，诱导 冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱 (opine)，作为农杆菌碳源 和氮源。 浙江大学 遗传学第十二章 32 }Ti质粒特点： 1. 具有五个主要功能区域： ①. T-DNA：LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组； ②. 质粒转移区(PT)； ③. 冠瘿碱(opine)代谢区； ④. 复制原点； ⑤. 毒性区。 浙江大学 遗传学第十二章 33 2. T-DNA中直接参与转移并整合的序列：T-DNA两端与 其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的这段 序列称为右界(RB)，左端的序列称为左界(LB)。 3. V区的毒性基因：T-DNA转移所必需，毒性基因可以 顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。 浙江大学 遗传学第十二章 34 } Ti质粒是200~500kb环状DNA分子，主要有两套载体系统： ⑴. 双元载体(binary vectors) ：该系统具有两个质粒： ①. 用于克隆外源基因片段的克隆质粒：在E. coli和农杆菌中复 制，容易操作，并可在二者间转移，是一种穿梭质粒； ②. 非致病质粒：具有毒性基因，没有T-DNA序列。 将两个质粒分别导入进农杆菌中，经农杆菌介导，克隆质粒中 的外源DNA转移到植物染色体中。 ⑵. 共整合载体(intergrated vectors)： 这个系统包括两个质粒，一个用作克隆外源基因，另一个具有 毒性基因，但这两个质粒具有一段同源序列，在农杆菌中重组整合 成一个载体。 浙江大学 遗传学第十二章 35 一般而言，一个基因 ¨ 是编码一条多肽链的一个DNA 片段，包括启动子、终止子及内含子等。 在DNA重组技术出现之前，由于DNA 分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难 分析的大分子。 DNA重组技术发展成功之后，DNA已 成为细胞中最易操作分析的大分子。 四、基因的分离与鉴定： 四、基因的分离与鉴定： 浙江大学 遗传学第十二章 36 DNA的体外重组： 1.体外通过限制性内切酶 的修剪和DNA连接酶的 连接； 2.目标DNA分子 + 载体 DNA，共价连接； 3.获得重组DNA分子
6 浙江大学 遗传学第十二章 31 农杆菌 感染产生 冠瘿瘤 ㈦、Ti质粒及其衍生载体： 适合于植物的载体系统¨将重组DNA运载到植物细胞中¨ 目的基因表达。 Ti质粒(细菌质粒)：自然存在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，革兰氏阴菌)细胞¨可诱导植物产生瘤细胞(tumorinducing, Ti) ¨冠瘿瘤(grown galltumors)。 Ti质粒有一部分转移DNA (transfer DNA，T-DNA)¨当农杆菌感染植物时， T-DNA便转移到植物染色体上，诱导 冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱 (opine)，作为农杆菌碳源 和氮源。 浙江大学 遗传学第十二章 32 }Ti质粒特点： 1. 具有五个主要功能区域： ①. T-DNA：LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组； ②. 质粒转移区(PT)； ③. 冠瘿碱(opine)代谢区； ④. 复制原点； ⑤. 毒性区。 浙江大学 遗传学第十二章 33 2. T-DNA中直接参与转移并整合的序列：T-DNA两端与 其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的这段 序列称为右界(RB)，左端的序列称为左界(LB)。 3. V区的毒性基因：T-DNA转移所必需，毒性基因可以 顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。 浙江大学 遗传学第十二章 34 } Ti质粒是200~500kb环状DNA分子，主要有两套载体系统： ⑴. 双元载体(binary vectors) ：该系统具有两个质粒： ①. 用于克隆外源基因片段的克隆质粒：在E. coli和农杆菌中复 制，容易操作，并可在二者间转移，是一种穿梭质粒； ②. 非致病质粒：具有毒性基因，没有T-DNA序列。 将两个质粒分别导入进农杆菌中，经农杆菌介导，克隆质粒中 的外源DNA转移到植物染色体中。 ⑵. 共整合载体(intergrated vectors)： 这个系统包括两个质粒，一个用作克隆外源基因，另一个具有 毒性基因，但这两个质粒具有一段同源序列，在农杆菌中重组整合 成一个载体。 浙江大学 遗传学第十二章 35 一般而言，一个基因 ¨ 是编码一条多肽链的一个DNA 片段，包括启动子、终止子及内含子等。 在DNA重组技术出现之前，由于DNA 分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难 分析的大分子。 DNA重组技术发展成功之后，DNA已 成为细胞中最易操作分析的大分子。 四、基因的分离与鉴定： 四、基因的分离与鉴定： 浙江大学 遗传学第十二章 36 DNA的体外重组： 1.体外通过限制性内切酶 的修剪和DNA连接酶的 连接； 2.目标DNA分子 + 载体 DNA，共价连接； 3.获得重组DNA分子
7 ㈠、从基因库中分离基因： 1. 基因库（library）： 是一组DNA和cDNA序 列克隆的集合体。从基因库 中分离基因，首先要构建 基因库。 根据克隆核酸序列、来 源，基因库可分为： 核基因库、染色体库、 cDNA库、线粒体库等。 散弹枪法构建基因文库 浙江大学 遗传学第十二章 38 ①. 核基因库 ： 核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成。 构建文库可采用不同的载体： 质粒载体：重组质粒导入感受态细胞¨收集菌落。 噬菌体或柯斯质粒 (cosmid)载体：将重组DNA包装进 噬菌体¨感染细菌¨收集噬菌斑。 BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体： 重组人工染色体¨导入宿主细胞¨收集细胞。 浙江大学 遗传学第十二章 39 ②. 染色体基因库： 将染色体用来构建基因库¨可选择特异基因和分析 染色体结构和组织。 如果蝇的多线 染色体：对染色体 进行微切割，可以 构建染色体区段的 基因文库。 人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离 (flow cytometry)技术将人类染色体分开¨构建单个染色体基因库 ¨加速人类基因组作图和分析。 流式细胞分离原理 分离染色体进行 涂色验证 浙江大学 遗传学第十二章 41 酵母菌： 利用改良的脉冲电泳方法(pulsed field gel electrophoresis, PFGE) ，将酵母菌16根染色体依据其分子量 大小分开后，用于构建染色体库，在基因组的分析中 发挥作用。 浙江大学 遗传学第十二章 42 ③. cDNA库： 以mRNA为模板Î反转录酶 合成互补DNA Î构建基因库。 真核生物mRNA3’端有一段 多聚A尾端 Î 双链DNA分子经 两端补齐 Î以带限制性酶切点 的人工接头连接Î酶切后与载 体(通常是噬菌体)连接 Î 制备 cDNA库。 cDNA库与核DNA库不同： cDNA库仅具有细胞或组织 内表达基因的mRNA序列Î仅包 括基因组的部分基因序列。 开始合成cDNA cDNA-RNA杂合双链 cDNA3’发夹结构 合成第二链 双链cDNA play-T引物
7 ㈠、从基因库中分离基因： 1. 基因库（library）： 是一组DNA和cDNA序 列克隆的集合体。从基因库 中分离基因，首先要构建 基因库。 根据克隆核酸序列、来 源，基因库可分为： 核基因库、染色体库、 cDNA库、线粒体库等。 散弹枪法构建基因文库 浙江大学 遗传学第十二章 38 ①. 核基因库 ： 核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成。 构建文库可采用不同的载体： 质粒载体：重组质粒导入感受态细胞¨收集菌落。 噬菌体或柯斯质粒 (cosmid)载体：将重组DNA包装进 噬菌体¨感染细菌¨收集噬菌斑。 BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体： 重组人工染色体¨导入宿主细胞¨收集细胞。 浙江大学 遗传学第十二章 39 ②. 染色体基因库： 将染色体用来构建基因库¨可选择特异基因和分析 染色体结构和组织。 如果蝇的多线 染色体：对染色体 进行微切割，可以 构建染色体区段的 基因文库。 人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离 (flow cytometry)技术将人类染色体分开¨构建单个染色体基因库 ¨加速人类基因组作图和分析。 流式细胞分离原理 分离染色体进行 涂色验证 浙江大学 遗传学第十二章 41 酵母菌： 利用改良的脉冲电泳方法(pulsed field gel electrophoresis, PFGE) ，将酵母菌16根染色体依据其分子量 大小分开后，用于构建染色体库，在基因组的分析中 发挥作用。 浙江大学 遗传学第十二章 42 ③. cDNA库： 以mRNA为模板Î反转录酶 合成互补DNA Î构建基因库。 真核生物mRNA3’端有一段 多聚A尾端 Î 双链DNA分子经 两端补齐 Î以带限制性酶切点 的人工接头连接Î酶切后与载 体(通常是噬菌体)连接 Î 制备 cDNA库。 cDNA库与核DNA库不同： cDNA库仅具有细胞或组织 内表达基因的mRNA序列Î仅包 括基因组的部分基因序列。 开始合成cDNA cDNA-RNA杂合双链 cDNA3’发夹结构 合成第二链 双链cDNA play-T引物
8 浙江大学 遗传学第十二章 43 2. 筛选基因库： 根据待选基因相关信息 Î 确定筛选方法和条件 Î从基因库中筛选、分离基因。 多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或 寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或 非放射性同位素标记探针 Î 筛选基因库。 浙江大学 遗传学第十二章 44 筛库过程： 将噬菌体感染形成的噬菌 斑印影在硝酸纤维膜上变性 Î 带有目的基因的放射性DNA或 cDNA作探针进行杂交Î放射性 自显影 Î 杂交信号（黑点）对 应的噬菌斑即为阳性克隆。 浙江大学 遗传学第十二章 45 3. 阳性克隆的分析与鉴定： 从基因库中筛选出阳性克隆 Î 分析、鉴定 Î 得到 目的基因。 ⑴. 限制性酶图谱： 构建阳性克隆的限制性酶图谱 Î 根据同源性分析， 了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置 Î 用于进一步 亚克隆或同已知的其它序列比较。 浙江大学 遗传学第十二章 46 CK Not I Sal I Not I + Sal I 图：一个 15kb DNA片段 的限制性酶图谱构建方法。 不同DNA用限制性酶酶切， 根据其产生的多型性，即限制 性酶片段长度的多型性 Î 来 分析DNA水平的变异程度， 以RFLP作为分子标记进行基因 组图谱分析。 9 浙江大学 遗传学第十二章 47 ⑵. 核酸分子杂交： ①. Southern杂交分析：由英国 Southern (1975)发明，将琼脂糖中 的DNA转移到尼龙膜Î进行DNA 分子杂交分析的方法。 筛选基因库得到阳性克隆Î将 限制性酶酶切与Southern杂交结合 Î绘制限制性酶图谱。 浙江大学 遗传学第十二章 48 ②. Northern杂交分析： 与Sorthern杂交的原理和程序相同。 用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平， 检测mRNA的存在
8 浙江大学 遗传学第十二章 43 2. 筛选基因库： 根据待选基因相关信息 Î 确定筛选方法和条件 Î从基因库中筛选、分离基因。 多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或 寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或 非放射性同位素标记探针 Î 筛选基因库。 浙江大学 遗传学第十二章 44 筛库过程： 将噬菌体感染形成的噬菌 斑印影在硝酸纤维膜上变性 Î 带有目的基因的放射性DNA或 cDNA作探针进行杂交Î放射性 自显影 Î 杂交信号（黑点）对 应的噬菌斑即为阳性克隆。 浙江大学 遗传学第十二章 45 3. 阳性克隆的分析与鉴定： 从基因库中筛选出阳性克隆 Î 分析、鉴定 Î 得到 目的基因。 ⑴. 限制性酶图谱： 构建阳性克隆的限制性酶图谱 Î 根据同源性分析， 了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置 Î 用于进一步 亚克隆或同已知的其它序列比较。 浙江大学 遗传学第十二章 46 CK Not I Sal I Not I + Sal I 图：一个 15kb DNA片段 的限制性酶图谱构建方法。 不同DNA用限制性酶酶切， 根据其产生的多型性，即限制 性酶片段长度的多型性 Î 来 分析DNA水平的变异程度， 以RFLP作为分子标记进行基因 组图谱分析。 9 浙江大学 遗传学第十二章 47 ⑵. 核酸分子杂交： ①. Southern杂交分析：由英国 Southern (1975)发明，将琼脂糖中 的DNA转移到尼龙膜Î进行DNA 分子杂交分析的方法。 筛选基因库得到阳性克隆Î将 限制性酶酶切与Southern杂交结合 Î绘制限制性酶图谱。 浙江大学 遗传学第十二章 48 ②. Northern杂交分析： 与Sorthern杂交的原理和程序相同。 用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平， 检测mRNA的存在
9 浙江大学 遗传学第十二章 49 ③. Western 杂交分析： 用于蛋白质的分析。 浙江大学 遗传学第十二章 50 ⑶. 核酸序列测定： 测定克隆后的DNA片段核酸序列 。 一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸 终止法测定核酸序列。 浙江大学 遗传学第十二章 51 在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记： ⑷. 核酸序列分析： 测定的核酸序列是否为基因、 有什么功能，需用计算机软件或 生物学实验进一步分析。 ①. 同源序列的分析： }同源性比较： 将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的同源性， 将序列发送到Blast等DNA Data数据库进行比较。 }阅读框架的分析： 一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有翻译起 始信号和终止信号等。 cDNA 序列可分析内含子等。 浙江大学 遗传学第十二章 53 ②. 无任何同源性的新序列： 进行基因功能性研究的方法： } 将基因导入生物体进行基因失活或过量表达，根据 表型推测基因作用； } 用噬菌体显现(phage display)技术； } 酵母双杂交系统进行蛋白质的功能分析。 浙江大学 遗传学第十二章 54 ㈡、PCR扩增基因： 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)可以 体外快速扩增DNA。 美国Mullis(1986)发明 (现代生物学发展史上的里程碑)。 PCR仪 离心机
9 浙江大学 遗传学第十二章 49 ③. Western 杂交分析： 用于蛋白质的分析。 浙江大学 遗传学第十二章 50 ⑶. 核酸序列测定： 测定克隆后的DNA片段核酸序列 。 一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸 终止法测定核酸序列。 浙江大学 遗传学第十二章 51 在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记： ⑷. 核酸序列分析： 测定的核酸序列是否为基因、 有什么功能，需用计算机软件或 生物学实验进一步分析。 ①. 同源序列的分析： }同源性比较： 将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的同源性， 将序列发送到Blast等DNA Data数据库进行比较。 }阅读框架的分析： 一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有翻译起 始信号和终止信号等。 cDNA 序列可分析内含子等。 浙江大学 遗传学第十二章 53 ②. 无任何同源性的新序列： 进行基因功能性研究的方法： } 将基因导入生物体进行基因失活或过量表达，根据 表型推测基因作用； } 用噬菌体显现(phage display)技术； } 酵母双杂交系统进行蛋白质的功能分析。 浙江大学 遗传学第十二章 54 ㈡、PCR扩增基因： 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)可以 体外快速扩增DNA。 美国Mullis(1986)发明 (现代生物学发展史上的里程碑)。 PCR仪 离心机
10 浙江大学 遗传学第十二章 55 PCR反应三个步聚 (一个循环)： 1. 变性：94~95℃使模板DNA双链 变成单链； 2. 复性：50~70℃下，引物分别与 互补DNA单链互补配对； 3. 延伸：在引物的引导和Taq酶作 用下，72 ℃下合成模板 DNA的互补链。 PCR反应通常有25~35个循环， 一般可扩增5kb左右的片段。 由该技术衍生出一些新的技术， 如RAPD和AFLP等技术。 浙江大学 遗传学第十二章 56 ㈢、人工合成基因： 根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成 DNA的方法结合起来 ¨ 可很快地人工合成基因。 如SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)技术 ¨ 可扩增出完整 的基因序列。 1. 化学合成的寡聚核苷酸(80 ~100个核苷酸) ¨通过SOE将单链 部分补齐； 2. PCR扩增DNA片段； 3. DNA变性； 4. 两个单链部分经SOE补齐¨ 双链； 5. PCR扩增DNA，利用多级 SOE-PCR 扩增出完整的基因。 浙江大学 遗传学第十二章 57 目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大 突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、 医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。 五、基因工程的应用： 五、基因工程的应用： 具有生长激素的 转基因鼠 浙江大学 遗传学第十二章 58 转 基 因 的 方 法 和 技 术 ： 浙江大学 遗传学第十二章 59 ㈠、基因工程工业： 最早应用基因工 程生产人的蛋白质的 方法是在细菌中表达 人的胰岛素(1982)。 基因工程生产人 的胰岛素的方法如图 所示。 浙江大学 遗传学第十二章 60 现已在细菌中生产10多种 药品，例如表皮生长因子、人 生长激素因子、干扰素、乙型 肝炎工程疫苗等。 目前，酵母菌、植物悬浮 细胞、植株和动物培养细胞均 成功地应用于表达外源蛋白。 基因工程应用大肠杆菌 生产人类生长激素
10 浙江大学 遗传学第十二章 55 PCR反应三个步聚 (一个循环)： 1. 变性：94~95℃使模板DNA双链 变成单链； 2. 复性：50~70℃下，引物分别与 互补DNA单链互补配对； 3. 延伸：在引物的引导和Taq酶作 用下，72 ℃下合成模板 DNA的互补链。 PCR反应通常有25~35个循环， 一般可扩增5kb左右的片段。 由该技术衍生出一些新的技术， 如RAPD和AFLP等技术。 浙江大学 遗传学第十二章 56 ㈢、人工合成基因： 根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成 DNA的方法结合起来 ¨ 可很快地人工合成基因。 如SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)技术 ¨ 可扩增出完整 的基因序列。 1. 化学合成的寡聚核苷酸(80 ~100个核苷酸) ¨通过SOE将单链 部分补齐； 2. PCR扩增DNA片段； 3. DNA变性； 4. 两个单链部分经SOE补齐¨ 双链； 5. PCR扩增DNA，利用多级 SOE-PCR 扩增出完整的基因。 浙江大学 遗传学第十二章 57 目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大 突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、 医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。 五、基因工程的应用： 五、基因工程的应用： 具有生长激素的 转基因鼠 浙江大学 遗传学第十二章 58 转 基 因 的 方 法 和 技 术 ： 浙江大学 遗传学第十二章 59 ㈠、基因工程工业： 最早应用基因工 程生产人的蛋白质的 方法是在细菌中表达 人的胰岛素(1982)。 基因工程生产人 的胰岛素的方法如图 所示。 浙江大学 遗传学第十二章 60 现已在细菌中生产10多种 药品，例如表皮生长因子、人 生长激素因子、干扰素、乙型 肝炎工程疫苗等。 目前，酵母菌、植物悬浮 细胞、植株和动物培养细胞均 成功地应用于表达外源蛋白。 基因工程应用大肠杆菌 生产人类生长激素