·1106 工程科学学报，第37卷，第8期 运输到鞭毛项端) 1.3插入突变、基因克隆及表达载体构建 T复合体高度保守且由两个亚复合体组成，分 按照Liang和Pan报道的电转化法的操作步 别为FTA和FTB.FTB复合体的核心蛋白包括 骤获得莱茵衣藻突变体，转化过程中采用TAP FT70、FT46、IFT88、FT81、FT74/72、FT52、IFT22、 (tris-acetate-phosphate)液体培养基培养野生型 FT25及FT27.有研究报道，FTB复合体蛋白的 莱茵衣藻 核心蛋白之间存在相互作用，且FT81/74/27/25复合 将线性化的外源片段aphⅧ（巴龙霉素抗性基因） 体与FT52有直接的相互作用同.另外，FT81和 导入野生型莱茵衣藻细胞中，从众多转化子中筛选获 FT7472的相互作用是保守的，也是鞭毛形成所必需 得运动缺陷突变体，应用限制性内切酶定点扩增PCR 的0.IFT74和FT81可以形成一个蛋白复合体起到 (restriction enzyme site-directed amplification PCR, 结合和运输其他蛋白的作用回 RESDA-PCR)鉴定外源片段在突变体衣藻基因组中的 TB复合体与鞭毛内的正向运输紧密相关，相 插入位置团 关蛋白缺陷常常造成鞭毛组装障碍，如FT46或者 通过PCR方式从野生型衣藻基因组DNA中克隆 FT88缺陷引起的短鞭毛或无鞭毛突变7.类似地， 5.5kb的含有完整F81基因（不包括终止密码子）和 在人类RPE1细胞中，FT81蛋白的缺陷会导致有纤 FT81基因的内源性启动子(1.3kb)的片段，再将一个 毛的细胞数量大幅下降网.可见FT81蛋白在调控纤 与终止子相连的3×HA(haemagglutinin,血凝素)蛋白 毛/鞭毛组装过程中有着重要作用. 标签加在5.5kb的基因序列之后，最后选择一个含有 单细胞真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonas 潮霉素(Hygromycin B)抗性基因的表达载体与 reinhardtii)作为一种模式生物，常用于研究鞭毛组装 IFT81HA连接并构建出完整的IFI81基因表达载体 和解聚的机制.然而，莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白FT81 利用电转化法将重组质粒导入突变体衣藻细胞中. 参与调控鞭毛组装尚未见突变体分析.本文通过插入 1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹实验采用 突变的方法，筛选出了不运动突变体81，序列分析发 Wang等的方法.细胞或蛋白样品用缓冲液A 现是IFT81基因缺陷.对该突变体的分析显示IFT81 (Buffer A)溶解并煮沸5~l0min后用来做聚丙烯酰胺 基因缺陷导致衣藻鞭毛变短或丧失，进一步的蛋白定 位和显微结构观察证实FT81蛋白在鞭毛组装过程中 凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析，每孔上样量为来自 1.5×10个细胞的裂解液 具有重要功能，这为揭示T81蛋白调控鞭毛组装机 1.5免疫荧光和电镜实验 理提供了基础数据 采用Wang等的方法完成细胞的免疫荧光实 1材料与方法 验.一抗为anti-x-tubulin(1:l00,Sigma)和rat mono- clonal anti-HA(1:100,clone3F10,Roche).二抗为 1.1藻株和试剂 Texas Red goat anti-mouse IgG (1 400,molecular 野生型莱茵衣藻株21gr(mt+)(CCH690)购自 probes)Alexa Fluor 488 goat anti-rat IgG (1:400, 美国明尼苏达大学衣藻中心.抗体anti-x-tubulin molecular probes).样品在Zeiss LSM780 META Observ-- (1:2500）)购自美国Sigma公司.抗体rat anti-HA er Z1 Confocal Laser Microscope(Zeiss,德国)上进行拍 (1:4000)购自瑞士Roche公司.抗体mouse anti-- 摄，并用ZEN2012(Zeiss),Adobe Photoshop和Adobe FT81(1:l000)由University of Idaho的Dr.Cole llustrator（Adobe,美国)软件对照片进行后续处理. 惠赠 采用一种优化技术完成电镜切片.细胞电镜切片 1.2细胞培养条件、DIC照片拍摄和鞭毛长度测量 在透射电镜(H650B,Hitachi Limited,日本)上进行 衣藻细胞培养于液体培养基，培养温度为23~ 拍摄. 24℃.培养条件为：R液体培养基连续光培养S/0代 (即直接从平板上挑取并转移到液体培养基培养的细 2结果与讨论 胞)，3~5d后转接至M液体培养基@，光周期培养 2.1不运动突变体a1324的筛选与性状分析 (光周期条件为14h光照与10h黑暗交替)3~5d.选 为获得衣藻不运动突变体，通过电转化的方式将 取M培养基光周期培养S/1代（将S/0代细胞转接1 外源DNA片段aphⅧ导入野生型衣藻21gr细胞之中. 次培养的继代细胞)或S/2代细胞（将S/0代细胞转 从3000个转化子中，筛选获得运动缺陷突变体7个， 接两次培养的继代细胞)进行微分干涉显微镜(differ-- 将其中的一株不运动突变体命名为af1324 ential interference microscope,DIC)照片拍摄，鞭毛长 野生型21gr细胞，有两个等长的鞭毛，其长度大 度测量采用已报道的方法如 约是12m,见图1(a).与野生型细胞不同，大部分突工程科学学报，第 37 卷，第 8 期 运输到鞭毛顶端［3］． IFT 复合体高度保守且由两个亚复合体组成，分 别为 IFT-A 和 IFT-B． IFT-B 复合体的核心蛋白包括 IFT70、IFT46、IFT88、IFT81、FT74 /72、IFT52、IFT22、 IFT25 及 IFT27［4］． 有研究报道，IFT-B 复合体蛋白的 核心蛋白之间存在相互作用，且 IFT81 /74 /27 /25 复合 体与 IFT52 有 直 接 的 相 互 作 用［5］． 另 外，IFT81 和 IFT74 /72 的相互作用是保守的，也是鞭毛形成所必需 的［4］． IFT74 和 IFT81 可以形成一个蛋白复合体起到 结合和运输其他蛋白的作用［6］． IFT-B 复合体与鞭毛内的正向运输紧密相关，相 关蛋白缺陷常常造成鞭毛组装障碍，如 IFT46 或 者 IFT88 缺陷引起的短鞭毛或无鞭毛突变［7--9］． 类似地， 在人类 ＲPE-1 细胞中，IFT81 蛋白的缺陷会导致有纤 毛的细胞数量大幅下降［6］． 可见 IFT81 蛋白在调控纤 毛/鞭毛组装过程中有着重要作用． 单 细 胞 真 核 生 物 莱 茵 衣 藻 ( Chlamydomonas reinhardtii) 作为一种模式生物，常用于研究鞭毛组装 和解聚的机制． 然而，莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白 IFT81 参与调控鞭毛组装尚未见突变体分析． 本文通过插入 突变的方法，筛选出了不运动突变体 ift81，序列分析发 现是 IFT81 基因缺陷． 对该突变体的分析显示 IFT81 基因缺陷导致衣藻鞭毛变短或丧失，进一步的蛋白定 位和显微结构观察证实 IFT81 蛋白在鞭毛组装过程中 具有重要功能，这为揭示 IFT81 蛋白调控鞭毛组装机 理提供了基础数据． 1 材料与方法 1. 1 藻株和试剂 野生型莱茵衣藻株 21gr ( mt + ) ( CC-1690) 购自 美国 明 尼 苏 达 大 学 衣 藻 中 心． 抗 体 anti-α-tubulin ( 1∶ 2500) 购 自 美 国 Sigma 公 司． 抗 体 rat anti-HA ( 1∶ 4000) 购 自 瑞 士 Ｒoche 公 司． 抗 体 mouse anti￾IFT81 ( 1 ∶ 1000 ) 由 University of Idaho 的 Dr． Cole 惠赠． 1. 2 细胞培养条件、DIC 照片拍摄和鞭毛长度测量 衣藻细胞培养于液体培养基，培养温度为 23 ～ 24 ℃ ． 培养条件为: Ｒ 液体培养基连续光培养 S /0 代 ( 即直接从平板上挑取并转移到液体培养基培养的细 胞) ，3 ～ 5 d 后转接至 M 液体培养基［10］，光周期培养 ( 光周期条件为 14 h 光照与 10 h 黑暗交替) 3 ～ 5 d． 选 取 M 培养基光周期培养 S /1 代( 将 S /0 代细胞转接 1 次培养的继代细胞) 或 S /2 代细胞( 将 S /0 代细胞转 接两次培养的继代细胞) 进行微分干涉显微镜( differ￾ential interference microscope，DIC) 照片拍摄，鞭毛长 度测量采用已报道的方法［11］． 1. 3 插入突变、基因克隆及表达载体构建 按照 Liang 和 Pan［11］报道的电转化法的操作步 骤获 得 莱 茵 衣 藻 突 变 体，转化过程中采用 TAP ( tris-acetate-phosphate) 液 体 培 养 基［12］ 培 养 野 生 型 莱茵衣藻． 将线性化的外源片段 aphⅧ( 巴龙霉素抗性基因) 导入野生型莱茵衣藻细胞中，从众多转化子中筛选获 得运动缺陷突变体，应用限制性内切酶定点扩增 PCＲ ( restriction enzyme site-directed amplification PCＲ， ＲESDA-PCＲ) 鉴定外源片段在突变体衣藻基因组中的 插入位置［13］． 通过 PCＲ 方式从野生型衣藻基因组 DNA 中克隆 5. 5 kb 的含有完整 IFT81 基因( 不包括终止密码子) 和 IFT81 基因的内源性启动子( 1. 3 kb) 的片段，再将一个 与终止子相连的 3 × HA ( haemagglutinin，血凝素) 蛋白 标签加在 5. 5 kb 的基因序列之后，最后选择一个含有 潮霉素 ( Hygromycin B) 抗性基因的表达载体［14］ 与 IFT81-HA 连接并构建出完整的 IFT81 基因表达载体． 利用电转化法将重组质粒导入突变体衣藻细胞中． 1. 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹实验采用 Wang 等［15］ 的 方 法． 细胞或蛋白样品用缓冲液 A ( Buffer A) 溶解并煮沸5 ～ 10 min 后用来做聚丙烯酰胺 凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析，每孔上样量为来自 1. 5 × 106 个细胞的裂解液． 1. 5 免疫荧光和电镜实验 采用 Wang 等［15］ 的方法完成细胞的免疫荧光实 验． 一抗为 anti-α-tubulin ( 1∶ 100，Sigma) 和 rat mono￾clonal anti-HA ( 1 ∶ 100，clone 3F10，Ｒoche) ． 二抗为 Texas Ｒed goat anti-mouse IgG ( 1 ∶ 400， molecular probes) 和 Alexa Fluor 488 goat anti-rat IgG ( 1 ∶ 400， molecular probes) ． 样品在 Zeiss LSM780 META Observ￾er Z1 Confocal Laser Microscope ( Zeiss，德国) 上进行拍 摄，并用 ZEN 2012 ( Zeiss) ，Adobe Photoshop 和 Adobe Illustrator ( Adobe，美国) 软件对照片进行后续处理． 采用一种优化技术完成电镜切片［16］． 细胞电镜切片 在透射电镜( H-7650B，Hitachi Limited，日本) 上进行 拍摄． 2 结果与讨论 2. 1 不运动突变体 af13-24 的筛选与性状分析 为获得衣藻不运动突变体，通过电转化的方式将 外源 DNA 片段 aphⅧ导入野生型衣藻 21gr 细胞之中． 从 3000 个转化子中，筛选获得运动缺陷突变体 7 个， 将其中的一株不运动突变体命名为 af13-24． 野生型 21gr 细胞，有两个等长的鞭毛，其长度大 约是 12 μm，见图 1( a) ． 与野生型细胞不同，大部分突 · 6011 ·