孙娟：莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白FT81调控鞭毛组装 *1107· 变体细胞在细胞分裂完成后不能正常分开，在液体培 运动突变体衣藻a1324是一种短鞭毛或鞭毛缺失 养基中细胞呈现出聚团生长的现象.在这些细胞团 突变 中，可以明显观察到短鞭毛的存在，见图1(b).经过 2.2突变体af1324的FT81基因缺陷 细胞壁溶解酶处理，突变体细胞可以从细胞团中分散 为了确定突变基因，将突变体基因组的RESDA- 开，单个的突变体细胞呈现出无鞭毛或者短鞭毛的多 PCR产物与pMD19T载体连接并测序，测序结果与莱 种性状，图1(c)~() 茵衣藻基因组(V4版本)进行比对.结果显示，突变体 (a) 的IFT81基因被外源基因破坏.IFI81基因有13个外 显子，其编码序列包括2052个碱基对，共编码683个 氨基酸，突变体的第五个外显子中插入了外源基因 aphⅧ，并且其中有52个碱基对被置换，见图2(a).因 此，突变体a1324被重新命名为81. 用Western Blot检测内源FT81蛋白的结果显示， FT81蛋白在野生型细胞中正常表达，而在突变体细 5 jm 胞中检测不到，见图2()，该结果与测序结果一致 为进一步确认F81基因缺陷是引起突变体性 状的原因，构建了含有完整IF81基因的互补载体， 见图2(b),并将环形互补质粒导入突变体81细胞 之中.从90个转化株中筛选得到三个性状恢复为野 60- (g) 生型的回复突变体，在这三株回复突变体中都可以 413-24 检测到IFT81HA融合蛋白的表达，见图2(d),其中 ☐21gr 0 的i81:FT81HA1#回复突变体被用于做后续实 验.另外，利用81蛋白的特异抗体，也可以在回 复突变株中成功检测到IFT81HA融合蛋白的表达， 见图2(e). 2.3突变体鞭毛的显微结构 电镜技术被用于进一步观察突变体81细胞鞭 毛的微观结构.将固定后的细胞切片，利用透射电镜 可以清晰地观察到衣藻鞭毛的显微结构，见图3.可以 鞭毛长度m 看出，野生型细胞鞭毛的横切面展示出典型的“9+2” 图1突变体与野生型衣藻微分干涉显微镜照片及鞭毛长度分 轴丝结构（图3(al),在过渡区有一个“H”型的结构 布图.(a)野生型21gr细胞：(b)突变体g1324细胞：(c)~ (图3(a3)),其纵切面则展示出了鞭毛内的FT粒子 ()细胞壁溶解酶处理后的突变体细胞：()突变体与野生型的 (图3(a2)). 鞭毛长度分布 突变体81细胞鞭毛的横切面展现“9+2”轴丝 Fig.1 DIC images of mutant and wild type cells,and flagellar length 结构（图3(b1)),鞭毛过渡区的“H”结构与野生型相 distribution:(a)wild type (21gr)cell:(b)mutant af1324 cells: 比有差异（图3(4）).短鞭毛的纵切面展示出有完整 (c)-(f)mutant cells after treatment of lysine:(g)flagellar length 鞭毛膜包被的轴丝，但是在部分短鞭毛的顶端出现了 distribution of mutants and the wild type 轴丝紊乱现象（图3(b2)~(b4)). 为了进一步分析突变体鞭毛的长度特征，用细胞 2.4鞭毛内运输蛋白FT81的定位 壁溶解酶处理获得分散的突变体细胞后统计鞭毛的长 确定鞭毛内运输蛋白IT81的定位是研究鞭毛组 度分布，见图1(g).在所有突变体细胞中，无鞭毛的 装机理的基础.回复突变体表达了FT81HA融合蛋 细胞占57%左右，鞭毛长度0~1m的细胞大约有 白，因此选用x-tubulin(微管蛋白)抗体（红色，对照） 20%,鞭毛长度1~2m的细胞有17%左右，鞭毛长度 和HA抗体（绿色），并利用免疫荧光实验检测. 2~3m的细胞约为4.5%，鞭毛长度3~4um的细胞 可以看出，HA荧光信号在野生型细胞(21gr)中 少于1.5%.与突变体不同的是，野生型21gr细胞的 检测不到，但同等条件下，回复突变体中的HA荧光信 两根等长的鞭毛主要分布于11~14um之间，70%左 号（绿色）集中于基体部位，鞭毛上也有点状的荧光信 右细胞的鞭毛都在11~14um:只有很少的细胞鞭毛 号分布，见图4.这些结果表明T81蛋白主要定位于 长度是小于11um或者大于14m.这些结果显示，不 基体，少量以点状形式沿着鞭毛分布.孙 娟: 莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白 IFT81 调控鞭毛组装 变体细胞在细胞分裂完成后不能正常分开，在液体培 养基中细胞呈现出聚团生长的现象． 在这些细胞团 中，可以明显观察到短鞭毛的存在，见图 1( b) ． 经过 细胞壁溶解酶处理，突变体细胞可以从细胞团中分散 开，单个的突变体细胞呈现出无鞭毛或者短鞭毛的多 种性状，图 1( c) ～ ( f) ． 图 1 突变体与野生型衣藻微分干涉显微镜照片及鞭毛长度分 布图． ( a) 野生型 21gr 细胞; ( b) 突变体 af13-24 细胞; ( c) ～ ( f) 细胞壁溶解酶处理后的突变体细胞; ( g) 突变体与野生型的 鞭毛长度分布 Fig． 1 DIC images of mutant and wild type cells，and flagellar length distribution: ( a) wild type ( 21gr) cell; ( b) mutant af13-24 cells; ( c) － ( f) mutant cells after treatment of lysine; ( g) flagellar length distribution of mutants and the wild type 为了进一步分析突变体鞭毛的长度特征，用细胞 壁溶解酶处理获得分散的突变体细胞后统计鞭毛的长 度分布，见图 1( g) ． 在所有突变体细胞中，无鞭毛的 细胞占 57% 左右，鞭毛长度 0 ～ 1 μm 的细胞大约有 20% ，鞭毛长度1 ～ 2 μm 的细胞有17% 左右，鞭毛长度 2 ～ 3 μm 的细胞约为 4. 5% ，鞭毛长度 3 ～ 4 μm 的细胞 少于 1. 5% ． 与突变体不同的是，野生型 21gr 细胞的 两根等长的鞭毛主要分布于 11 ～ 14 μm 之间，70% 左 右细胞的鞭毛都在 11 ～ 14 μm; 只有很少的细胞鞭毛 长度是小于 11 μm 或者大于 14 μm． 这些结果显示，不 运动突变体衣藻 af13-24 是一种短鞭 毛 或 鞭 毛 缺 失 突变． 2. 2 突变体 af13-24 的 IFT81 基因缺陷 为了确定突变基因，将突变体基因组的 ＲESDA￾PCＲ 产物与 pMD19-T 载体连接并测序，测序结果与莱 茵衣藻基因组( V4 版本) 进行比对． 结果显示，突变体 的 IFT81 基因被外源基因破坏． IFT81 基因有 13 个外 显子，其编码序列包括 2052 个碱基对，共编码 683 个 氨基酸，突变体的第五个外显子中插入了外源基因 aphⅧ，并且其中有 52 个碱基对被置换，见图 2( a) ． 因 此，突变体 af13-24 被重新命名为 ift81． 用 Western Blot 检测内源 IFT81 蛋白的结果显示， IFT81 蛋白在野生型细胞中正常表达，而在突变体细 胞中检测不到，见图 2( c) ，该结果与测序结果一致． 为进一步确认 IFT81 基因缺陷是引起突变体性 状的原因，构建了含有完整 IFT81 基因的互补载体， 见图 2( b) ，并将环形互补质粒导入突变体 ift81 细胞 之中． 从 90 个转化株中筛选得到三个性状恢复为野 生型的回复突变体，在这三株回复突变体中都可以 检测到 IFT81-HA 融合蛋白的表达，见图 2( d) ，其中 的 ift81∷IFT81-HA1 #回 复 突 变 体 被 用 于 做 后 续 实 验． 另外，利用 IFT81 蛋白的特异抗体，也可以在回 复突变株中成功检测到 IFT81-HA 融合蛋白的表达， 见图 2( e) ． 2. 3 突变体鞭毛的显微结构 电镜技术被用于进一步观察突变体 ift81 细胞鞭 毛的微观结构． 将固定后的细胞切片，利用透射电镜 可以清晰地观察到衣藻鞭毛的显微结构，见图 3． 可以 看出，野生型细胞鞭毛的横切面展示出典型的“9 + 2” 轴丝结构( 图 3( a1) ) ，在过渡区有一个“H”型的结构 ( 图 3( a3) ) ，其纵切面则展示出了鞭毛内的 IFT 粒子 ( 图 3( a2) ) ． 突变体 ift81 细胞鞭毛的横切面展现“9 + 2”轴丝 结构( 图 3( b1) ) ，鞭毛过渡区的“H”结构与野生型相 比有差异( 图 3( b4) ) ． 短鞭毛的纵切面展示出有完整 鞭毛膜包被的轴丝，但是在部分短鞭毛的顶端出现了 轴丝紊乱现象( 图 3( b2) ～ ( b4) ) ． 2. 4 鞭毛内运输蛋白 IFT81 的定位 确定鞭毛内运输蛋白 IFT81 的定位是研究鞭毛组 装机理的基础． 回复突变体表达了 IFT81-HA 融合蛋 白，因此选用 α-tubulin( 微管蛋白) 抗体( 红色，对照) 和 HA 抗体( 绿色) ，并利用免疫荧光实验检测． 可以看出，HA 荧光信号在野生型细胞( 21gr) 中 检测不到，但同等条件下，回复突变体中的 HA 荧光信 号( 绿色) 集中于基体部位，鞭毛上也有点状的荧光信 号分布，见图 4． 这些结果表明 IFT81 蛋白主要定位于 基体，少量以点状形式沿着鞭毛分布． · 7011 ·