·1108* 工程科学学报，第37卷，第8期 (a) HA蛋白 3UTR 微管蛋白 融合图 S'UTR ATTGAGCTGCACAAGAG (b) Kpn I BgⅡXbal I Hyg+ IFT81 gDNA with 5'UTR 日A c (d) 8121r 95 kDa- -FS1-2 081FT81-HA1 净81-IT81-HA3 +T81 72 kDa- anti-HA i81:IFT81-HAI nti-Tubulin 5 图4野生型细胞和回复突变体细胞的免疫荧光图片 Fig.4 Immunofluorescence images of wild type and rescued strain anti-IFT81 cells anti-Tubulin 细胞周期完成后生成两根等长的鞭毛(11~14μm) 图2突变体插入位点及相关蛋白表达电泳图.()突变体中 然而，缺乏完整FT81基因的突变体81却不能形成 phⅧ插入位点示意图，深色方框显示FT81基因的13个外显 鞭毛或者只能组装成两根很短的鞭毛。突变体81 子：(b)野生型IFT81基因互补载体示意图：(c)用FT81蛋白 的基因结构分析表明，外源基因aphⅧ整合到了IFT81 特异抗体检测野生型细胞21gr和突变体细胞81中FT81蛋白 基因的第五个外显子之中，并且替换了其中的52个碱 表达情况的Vestern blot:(d)用抗HA标签蛋白的抗体检测回 基对.蛋白免疫印迹分析表明，FT81蛋白在野生型细 复突变体中FT81HA融合蛋白的表达：(c)用FT81特异抗体 检测回复突变体中IFT81蛋白的表达 胞中可以正常表达，而在突变体细胞中则没有正常表 Fig.2 Insertion site information and Western blot information of 达.导入完整IFT81基因后，突变体鞭毛的性状又得 related proteins:(a)schematic diagram of insertion site,where the 以恢复为正常，说明该突变体的表型确实是由于 dark boxes represent the thirteen extrons of gene IF81:(b)sche- IFT81基因的缺失导致的. matic diagram of WT (wild type)IFT81 gene rescued plasmid:(c) FT81是非常保守的蛋白，在人类RPE!细胞中 the Western blot with anti-FT81 antibody showed IFT81 protein 利用RNAi技术抑制FI81会使得长有纤毛的细胞数 expression levels:(d)rescued strains tested by the Westem blot with anti-HA:(e)rescued strains tested by the Westem blot with anti- 量大大降低网.以上结果第一次在遗传上证明T81 IFT81 antibodies 蛋白在鞭毛组装过程中是至关重要的，其缺失会引起 鞭毛组装功能障碍. (al) (bl) n3) 2.6FT81和FT74/72蛋白模块运输机制 鞭毛和纤毛在生物的生命活动中都扮演着重要的 角色.在鞭毛生长的过程中，新的轴丝蛋白会添加在 轴丝的顶端，使得鞭毛不断生长.因为鞭毛内部缺乏 112 合成蛋白的相关机制，只能在细胞体内合成鞭毛相关 100nm 蛋白再运输到鞭毛内部完成组装，这就是鞭毛内运输 4 机制(FT机制).FT是一种双向运输系统，正向的运 输与ITB复合体有关，而反向的运输主要与FT-A 复合体相关.在鞭毛组装过程中，相关前体蛋白不断 地从胞体聚集到鞭毛的基部，与FT复合体结合之后 图3野生型细胞鞭毛和突变体81细胞鞭毛的显微结构 再进入鞭毛内，并在鞭毛的顶端完成组装。另外，在鞭 (al)~(a3)野生型细胞鞭毛：(b1)~(b4)突变体细胞鞭毛 毛长度的维持过程中，T系统对相关物质的输入和 Fig.3 Electron microscopy images showing the ultrastructure of wild 输出也是必要的7- type and mutant flagella:(al)-(a3)wild type;(bl)-(b4) 根据文献报道，TB复合体的核心蛋白包含一 mutant cells 个小的四聚体，该四聚体由两个T74/72和两个 2.5莱茵衣藻FT81蛋白的缺失引起鞭毛组装功能 FT81蛋白组成0.其中，FT81有结合微管蛋白的保 障碍 守位点(N端)以及与IFT74结合的卷曲螺旋(coiled.- 依赖于鞭毛内运输机制，野生型衣藻可以在每个 coil)区域，FT81和FT74蛋白结合并形成一个蛋白模工程科学学报，第 37 卷，第 8 期 图 2 突变体插入位点及相关蛋白表达电泳图． ( a) 突变体中 aphⅧ插入位点示意图，深色方框显示 IFT81 基因的 13 个外显 子; ( b) 野生型 IFT81 基因互补载体示意图; ( c) 用 IFT81 蛋白 特异抗体检测野生型细胞 21gr 和突变体细胞 ift81 中 IFT81 蛋白 表达情况的 Western blot; ( d) 用抗 HA 标签蛋白的抗体检测回 复突变体中 IFT81-HA 融合蛋白的表达; ( e) 用 IFT81 特异抗体 检测回复突变体中 IFT81 蛋白的表达 Fig． 2 Insertion site information and Western blot information of related proteins: ( a) schematic diagram of insertion site，where the dark boxes represent the thirteen extrons of gene IFT81; ( b) sche￾matic diagram of WT ( wild type) IFT81 gene rescued plasmid; ( c) the Western blot with anti-IFT81 antibody showed IFT81 protein expression levels; ( d) rescued strains tested by the Western blot with anti-HA; ( e) rescued strains tested by the Western blot with anti￾IFT81 antibodies 图 3 野生型细胞鞭毛和突变体 ift81 细胞鞭毛的显微结构． ( a1) ～ ( a3) 野生型细胞鞭毛; ( b1) ～ ( b4) 突变体细胞鞭毛 Fig． 3 Electron microscopy images showing the ultrastructure of wild type and mutant flagella: ( a1 ) － ( a3 ) wild type; ( b1 ) － ( b4 ) mutant cells 2. 5 莱茵衣藻 IFT81 蛋白的缺失引起鞭毛组装功能 障碍 依赖于鞭毛内运输机制，野生型衣藻可以在每个 图 4 野生型细胞和回复突变体细胞的免疫荧光图片 Fig． 4 Immunofluorescence images of wild type and rescued strain cells 细胞周期完成后生成两根等长的鞭毛( 11 ～ 14 μm) ． 然而，缺乏完整 IFT81 基因的突变体 ift81 却不能形成 鞭毛或者只能组装成两根很短的鞭毛． 突变体 ift81 的基因结构分析表明，外源基因 aphⅧ整合到了 IFT81 基因的第五个外显子之中，并且替换了其中的 52 个碱 基对． 蛋白免疫印迹分析表明，IFT81 蛋白在野生型细 胞中可以正常表达，而在突变体细胞中则没有正常表 达． 导入完整 IFT81 基因后，突变体鞭毛的性状又得 以恢复 为 正 常，说 明 该 突 变 体 的 表 型 确 实 是 由 于 IFT81 基因的缺失导致的． IFT81 是非常保守的蛋白，在人类 ＲPE-1 细胞中 利用 ＲNAi 技术抑制 IFT81 会使得长有纤毛的细胞数 量大大降低［6］． 以上结果第一次在遗传上证明 IFT81 蛋白在鞭毛组装过程中是至关重要的，其缺失会引起 鞭毛组装功能障碍． 2. 6 IFT81 和 IFT74 /72 蛋白模块运输机制 鞭毛和纤毛在生物的生命活动中都扮演着重要的 角色． 在鞭毛生长的过程中，新的轴丝蛋白会添加在 轴丝的顶端，使得鞭毛不断生长． 因为鞭毛内部缺乏 合成蛋白的相关机制，只能在细胞体内合成鞭毛相关 蛋白再运输到鞭毛内部完成组装，这就是鞭毛内运输 机制( IFT 机制) ． IFT 是一种双向运输系统，正向的运 输与 IFT-B 复合体有关，而反向的运输主要与 IFT-A 复合体相关． 在鞭毛组装过程中，相关前体蛋白不断 地从胞体聚集到鞭毛的基部，与 IFT 复合体结合之后 再进入鞭毛内，并在鞭毛的顶端完成组装． 另外，在鞭 毛长度的维持过程中，IFT 系统对相关物质的输入和 输出也是必要的［17--18］． 根据文献报道，IFT-B 复合体的核心蛋白包含一 个小的 四 聚 体，该 四 聚 体 由 两 个 IFT74 /72 和 两 个 IFT81 蛋白组成［4］． 其中，IFT81 有结合微管蛋白的保 守位点( N-端) 以及与 IFT74 结合的卷曲螺旋( coiled￾coil) 区域，IFT81 和 IFT74 蛋白结合并形成一个蛋白模 · 8011 ·