莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白IFT81调控鞭毛组装

工程科学学报，第37卷，第8期：11051109,2015年8月 Chinese Journal of Engineering,Vol.37,No.8:1105-1109,August 2015 D0l:10.13374/j.issn2095-9389.2015.08.020:http://journals..ustb.edu.cn 莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白IFT81调控鞭毛组装 孙 娟四 清华大学生命科学学院，北京100084 ☒通信作者，E-mail:sunjuan11@mails.tsinghua..cdu.cn 摘要利用插入突变的方式获得了一株衣藻不运动突变体81，该突变体表现出鞭毛缺失或者短鞭毛的性状.基因序列 分析表明，外源基因aphⅧ插入了突变体中IFT81(intraflagellar transport,FT)基因的第五个外显子内，并导致该外显子原有 的52个碱基对被替换.把含有完整FT81基因的重组质粒导入突变体81后，其鞭毛恢复为野生型且可以检测到FT81HA 融合蛋白的表达，这证明突变体的鞭毛缺陷确实是由于F81基因突变所导致.电镜观察显示突变体中鞭毛的显微结构发生 改变，免疫荧光实验证实FT81蛋白主要定位于基体和鞭毛部位.上述结果表明：FT81蛋白缺失会导致衣藻鞭毛组装缺陷， 在鞭毛组装所需蛋白的运输过程中，FT81蛋白是必不可少的 关键词莱茵衣藻：鞭毛：组装：蛋白 分类号Q291 Flagellar assembly in Chlamydomonas reinhardtii regulated by intraflagellar transport protein IFT81 SUN Juan School of Life Science,Tsinghua University,Beijing 100084,China Corresponding author,E-mail:sunjuanl1@mails.tsinghua.edu.cn ABSTRACT A Chlamydomonas reinhardtii immobile mutant named ifi81 was screened by insertional mutagenesis.The mutant was bald or with two short flagella.Gene sequencing confirmed that fifty-two base pairs in the fifth extron of /F781 gene were replaced by the exogenous gene aphv in the mutant.After a recombinant plasmid containing full IFT81 gene was imported into the mutant if81, the phenotype of the mutant was rescued and the expression of IFT81HA could be detected,which confirmed that the defect in /F781 gene led to the abnormal flagella directly.Electron microscopy images exhibited the abnormal flagella of the mutant.An immunofluo- rescence assay revealed that IFT81 protein was localized to the basal body and flagella.This work shows that loss of protein IFT81 will directly lead to the defects of flagellar assembly,and IFT81 protein is indispensable for flagellar assembly in Chlamydomonas reinhardtii. KEY WORDS Chlamydomonas reinhardtii;flagella:assembly:protein 纤毛/鞭毛作为一种高度保守的细胞器广泛存在 dyskinesia,PCD)在内的多种疾病0.鞭毛缺陷导致致 于真核生物的细胞中，而且与信号转导、动物发育等密 病的机理尚不完全清楚，有报道指出鞭毛内运输缺陷 切相关.纤毛/鞭毛的组装、解聚和维持受到精确的调 是引发很多疾病的原因回.纤毛/鞭毛是一种基于微 控，其缺陷往往会引起一系列疾病.在人体中，纤毛/ 管而存在的细胞结构组织，其本身缺乏蛋白合成的机 鞭毛的缺陷会引起包括多囊肾病(polycystic kidney 制.一种非常保守的纤毛/鞭毛内运输机制 disease,PKD)和原发性纤毛运动障碍(primary ciliary (Intraflagellar transport,IFT)负责将蛋白从细胞胞体 收稿日期：20140304

工程科学学报，第 37 卷，第 8 期: 1105--1109，2015 年 8 月 Chinese Journal of Engineering，Vol． 37，No． 8: 1105--1109，August 2015 DOI: 10． 13374 /j． issn2095--9389． 2015． 08． 020; http: / /journals． ustb． edu． cn 莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白 IFT81 调控鞭毛组装 孙 娟 清华大学生命科学学院，北京 100084  通信作者，E-mail: sunjuan11@ mails． tsinghua． edu． cn 摘 要 利用插入突变的方式获得了一株衣藻不运动突变体 ift81，该突变体表现出鞭毛缺失或者短鞭毛的性状． 基因序列 分析表明，外源基因 aphⅧ插入了突变体中 IFT81( intraflagellar transport，IFT) 基因的第五个外显子内，并导致该外显子原有 的 52 个碱基对被替换． 把含有完整 IFT81 基因的重组质粒导入突变体 ift81 后，其鞭毛恢复为野生型且可以检测到 IFT81-HA 融合蛋白的表达，这证明突变体的鞭毛缺陷确实是由于 IFT81 基因突变所导致． 电镜观察显示突变体中鞭毛的显微结构发生 改变，免疫荧光实验证实 IFT81 蛋白主要定位于基体和鞭毛部位． 上述结果表明: IFT81 蛋白缺失会导致衣藻鞭毛组装缺陷， 在鞭毛组装所需蛋白的运输过程中，IFT81 蛋白是必不可少的． 关键词 莱茵衣藻; 鞭毛; 组装; 蛋白 分类号 Q291 Flagellar assembly in Chlamydomonas reinhardtii regulated by intraflagellar transport protein IFT81 SUN Juan School of Life Science，Tsinghua University，Beijing 100084，China  Corresponding author，E-mail: sunjuan11@ mails． tsinghua． edu． cn ABSTＲACT A Chlamydomonas reinhardtii immobile mutant named ift81 was screened by insertional mutagenesis． The mutant was bald or with two short flagella． Gene sequencing confirmed that fifty-two base pairs in the fifth extron of IFT81 gene were replaced by the exogenous gene aphⅧ in the mutant． After a recombinant plasmid containing full IFT81 gene was imported into the mutant ift81， the phenotype of the mutant was rescued and the expression of IFT81-HA could be detected，which confirmed that the defect in IFT81 gene led to the abnormal flagella directly． Electron microscopy images exhibited the abnormal flagella of the mutant． An immunofluo￾rescence assay revealed that IFT81 protein was localized to the basal body and flagella． This work shows that loss of protein IFT81 will directly lead to the defects of flagellar assembly，and IFT81 protein is indispensable for flagellar assembly in Chlamydomonas reinhardtii． KEY WOＲDS Chlamydomonas reinhardtii; flagella; assembly; protein 收稿日期: 2014--03--04 纤毛/鞭毛作为一种高度保守的细胞器广泛存在 于真核生物的细胞中，而且与信号转导、动物发育等密 切相关． 纤毛/鞭毛的组装、解聚和维持受到精确的调 控，其缺陷往往会引起一系列疾病． 在人体中，纤毛/ 鞭毛的 缺 陷 会 引 起 包 括 多 囊 肾 病 ( polycystic kidney disease，PKD) 和原发性纤毛运动障碍( primary ciliary dyskinesia，PCD) 在内的多种疾病［1］． 鞭毛缺陷导致致 病的机理尚不完全清楚，有报道指出鞭毛内运输缺陷 是引发很多疾病的原因［2］． 纤毛/鞭毛是一种基于微 管而存在的细胞结构组织，其本身缺乏蛋白合成的机 制． 一种非常保守的纤毛/鞭 毛 内 运 输 机 制 ( Intraflagellar transport，IFT) 负责将蛋白从细胞胞体

·1106 工程科学学报，第37卷，第8期 运输到鞭毛项端) 1.3插入突变、基因克隆及表达载体构建 T复合体高度保守且由两个亚复合体组成，分 按照Liang和Pan报道的电转化法的操作步 别为FTA和FTB.FTB复合体的核心蛋白包括 骤获得莱茵衣藻突变体，转化过程中采用TAP FT70、FT46、IFT88、FT81、FT74/72、FT52、IFT22、 (tris-acetate-phosphate)液体培养基培养野生型 FT25及FT27.有研究报道，FTB复合体蛋白的 莱茵衣藻 核心蛋白之间存在相互作用，且FT81/74/27/25复合 将线性化的外源片段aphⅧ（巴龙霉素抗性基因） 体与FT52有直接的相互作用同.另外，FT81和 导入野生型莱茵衣藻细胞中，从众多转化子中筛选获 FT7472的相互作用是保守的，也是鞭毛形成所必需 得运动缺陷突变体，应用限制性内切酶定点扩增PCR 的0.IFT74和FT81可以形成一个蛋白复合体起到 (restriction enzyme site-directed amplification PCR, 结合和运输其他蛋白的作用回 RESDA-PCR)鉴定外源片段在突变体衣藻基因组中的 TB复合体与鞭毛内的正向运输紧密相关，相 插入位置团 关蛋白缺陷常常造成鞭毛组装障碍，如FT46或者 通过PCR方式从野生型衣藻基因组DNA中克隆 FT88缺陷引起的短鞭毛或无鞭毛突变7.类似地， 5.5kb的含有完整F81基因（不包括终止密码子）和 在人类RPE1细胞中，FT81蛋白的缺陷会导致有纤 FT81基因的内源性启动子(1.3kb)的片段，再将一个 毛的细胞数量大幅下降网.可见FT81蛋白在调控纤 与终止子相连的3×HA(haemagglutinin,血凝素)蛋白 毛/鞭毛组装过程中有着重要作用. 标签加在5.5kb的基因序列之后，最后选择一个含有 单细胞真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonas 潮霉素(Hygromycin B)抗性基因的表达载体与 reinhardtii)作为一种模式生物，常用于研究鞭毛组装 IFT81HA连接并构建出完整的IFI81基因表达载体 和解聚的机制.然而，莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白FT81 利用电转化法将重组质粒导入突变体衣藻细胞中. 参与调控鞭毛组装尚未见突变体分析.本文通过插入 1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹实验采用 突变的方法，筛选出了不运动突变体81，序列分析发 Wang等的方法.细胞或蛋白样品用缓冲液A 现是IFT81基因缺陷.对该突变体的分析显示IFT81 (Buffer A)溶解并煮沸5~l0min后用来做聚丙烯酰胺 基因缺陷导致衣藻鞭毛变短或丧失，进一步的蛋白定 位和显微结构观察证实FT81蛋白在鞭毛组装过程中 凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析，每孔上样量为来自 1.5×10个细胞的裂解液 具有重要功能，这为揭示T81蛋白调控鞭毛组装机 1.5免疫荧光和电镜实验 理提供了基础数据 采用Wang等的方法完成细胞的免疫荧光实 1材料与方法 验.一抗为anti-x-tubulin(1:l00,Sigma)和rat mono- clonal anti-HA(1:100,clone3F10,Roche).二抗为 1.1藻株和试剂 Texas Red goat anti-mouse IgG (1 400,molecular 野生型莱茵衣藻株21gr(mt+)(CCH690)购自 probes)Alexa Fluor 488 goat anti-rat IgG (1:400, 美国明尼苏达大学衣藻中心.抗体anti-x-tubulin molecular probes).样品在Zeiss LSM780 META Observ-- (1:2500）)购自美国Sigma公司.抗体rat anti-HA er Z1 Confocal Laser Microscope(Zeiss,德国)上进行拍 (1:4000)购自瑞士Roche公司.抗体mouse anti-- 摄，并用ZEN2012(Zeiss),Adobe Photoshop和Adobe FT81(1:l000)由University of Idaho的Dr.Cole llustrator（Adobe,美国)软件对照片进行后续处理. 惠赠 采用一种优化技术完成电镜切片.细胞电镜切片 1.2细胞培养条件、DIC照片拍摄和鞭毛长度测量 在透射电镜(H650B,Hitachi Limited,日本)上进行 衣藻细胞培养于液体培养基，培养温度为23~ 拍摄. 24℃.培养条件为：R液体培养基连续光培养S/0代 (即直接从平板上挑取并转移到液体培养基培养的细 2结果与讨论 胞)，3~5d后转接至M液体培养基@，光周期培养 2.1不运动突变体a1324的筛选与性状分析 (光周期条件为14h光照与10h黑暗交替)3~5d.选 为获得衣藻不运动突变体，通过电转化的方式将 取M培养基光周期培养S/1代（将S/0代细胞转接1 外源DNA片段aphⅧ导入野生型衣藻21gr细胞之中. 次培养的继代细胞)或S/2代细胞（将S/0代细胞转 从3000个转化子中，筛选获得运动缺陷突变体7个， 接两次培养的继代细胞)进行微分干涉显微镜(differ-- 将其中的一株不运动突变体命名为af1324 ential interference microscope,DIC)照片拍摄，鞭毛长 野生型21gr细胞，有两个等长的鞭毛，其长度大 度测量采用已报道的方法如 约是12m,见图1(a).与野生型细胞不同，大部分突

工程科学学报，第 37 卷，第 8 期 运输到鞭毛顶端［3］． IFT 复合体高度保守且由两个亚复合体组成，分 别为 IFT-A 和 IFT-B． IFT-B 复合体的核心蛋白包括 IFT70、IFT46、IFT88、IFT81、FT74 /72、IFT52、IFT22、 IFT25 及 IFT27［4］． 有研究报道，IFT-B 复合体蛋白的 核心蛋白之间存在相互作用，且 IFT81 /74 /27 /25 复合 体与 IFT52 有 直 接 的 相 互 作 用［5］． 另 外，IFT81 和 IFT74 /72 的相互作用是保守的，也是鞭毛形成所必需 的［4］． IFT74 和 IFT81 可以形成一个蛋白复合体起到 结合和运输其他蛋白的作用［6］． IFT-B 复合体与鞭毛内的正向运输紧密相关，相 关蛋白缺陷常常造成鞭毛组装障碍，如 IFT46 或 者 IFT88 缺陷引起的短鞭毛或无鞭毛突变［7--9］． 类似地， 在人类 ＲPE-1 细胞中，IFT81 蛋白的缺陷会导致有纤 毛的细胞数量大幅下降［6］． 可见 IFT81 蛋白在调控纤 毛/鞭毛组装过程中有着重要作用． 单 细 胞 真 核 生 物 莱 茵 衣 藻 ( Chlamydomonas reinhardtii) 作为一种模式生物，常用于研究鞭毛组装 和解聚的机制． 然而，莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白 IFT81 参与调控鞭毛组装尚未见突变体分析． 本文通过插入 突变的方法，筛选出了不运动突变体 ift81，序列分析发 现是 IFT81 基因缺陷． 对该突变体的分析显示 IFT81 基因缺陷导致衣藻鞭毛变短或丧失，进一步的蛋白定 位和显微结构观察证实 IFT81 蛋白在鞭毛组装过程中 具有重要功能，这为揭示 IFT81 蛋白调控鞭毛组装机 理提供了基础数据． 1 材料与方法 1. 1 藻株和试剂 野生型莱茵衣藻株 21gr ( mt + ) ( CC-1690) 购自 美国 明 尼 苏 达 大 学 衣 藻 中 心． 抗 体 anti-α-tubulin ( 1∶ 2500) 购 自 美 国 Sigma 公 司． 抗 体 rat anti-HA ( 1∶ 4000) 购 自 瑞 士 Ｒoche 公 司． 抗 体 mouse anti￾IFT81 ( 1 ∶ 1000 ) 由 University of Idaho 的 Dr． Cole 惠赠． 1. 2 细胞培养条件、DIC 照片拍摄和鞭毛长度测量 衣藻细胞培养于液体培养基，培养温度为 23 ～ 24 ℃ ． 培养条件为: Ｒ 液体培养基连续光培养 S /0 代 ( 即直接从平板上挑取并转移到液体培养基培养的细 胞) ，3 ～ 5 d 后转接至 M 液体培养基［10］，光周期培养 ( 光周期条件为 14 h 光照与 10 h 黑暗交替) 3 ～ 5 d． 选 取 M 培养基光周期培养 S /1 代( 将 S /0 代细胞转接 1 次培养的继代细胞) 或 S /2 代细胞( 将 S /0 代细胞转 接两次培养的继代细胞) 进行微分干涉显微镜( differ￾ential interference microscope，DIC) 照片拍摄，鞭毛长 度测量采用已报道的方法［11］． 1. 3 插入突变、基因克隆及表达载体构建 按照 Liang 和 Pan［11］报道的电转化法的操作步 骤获 得 莱 茵 衣 藻 突 变 体，转化过程中采用 TAP ( tris-acetate-phosphate) 液 体 培 养 基［12］ 培 养 野 生 型 莱茵衣藻． 将线性化的外源片段 aphⅧ( 巴龙霉素抗性基因) 导入野生型莱茵衣藻细胞中，从众多转化子中筛选获 得运动缺陷突变体，应用限制性内切酶定点扩增 PCＲ ( restriction enzyme site-directed amplification PCＲ， ＲESDA-PCＲ) 鉴定外源片段在突变体衣藻基因组中的 插入位置［13］． 通过 PCＲ 方式从野生型衣藻基因组 DNA 中克隆 5. 5 kb 的含有完整 IFT81 基因( 不包括终止密码子) 和 IFT81 基因的内源性启动子( 1. 3 kb) 的片段，再将一个 与终止子相连的 3 × HA ( haemagglutinin，血凝素) 蛋白 标签加在 5. 5 kb 的基因序列之后，最后选择一个含有 潮霉素 ( Hygromycin B) 抗性基因的表达载体［14］ 与 IFT81-HA 连接并构建出完整的 IFT81 基因表达载体． 利用电转化法将重组质粒导入突变体衣藻细胞中． 1. 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹实验采用 Wang 等［15］ 的 方 法． 细胞或蛋白样品用缓冲液 A ( Buffer A) 溶解并煮沸5 ～ 10 min 后用来做聚丙烯酰胺 凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析，每孔上样量为来自 1. 5 × 106 个细胞的裂解液． 1. 5 免疫荧光和电镜实验 采用 Wang 等［15］ 的方法完成细胞的免疫荧光实 验． 一抗为 anti-α-tubulin ( 1∶ 100，Sigma) 和 rat mono￾clonal anti-HA ( 1 ∶ 100，clone 3F10，Ｒoche) ． 二抗为 Texas Ｒed goat anti-mouse IgG ( 1 ∶ 400， molecular probes) 和 Alexa Fluor 488 goat anti-rat IgG ( 1 ∶ 400， molecular probes) ． 样品在 Zeiss LSM780 META Observ￾er Z1 Confocal Laser Microscope ( Zeiss，德国) 上进行拍 摄，并用 ZEN 2012 ( Zeiss) ，Adobe Photoshop 和 Adobe Illustrator ( Adobe，美国) 软件对照片进行后续处理． 采用一种优化技术完成电镜切片［16］． 细胞电镜切片 在透射电镜( H-7650B，Hitachi Limited，日本) 上进行 拍摄． 2 结果与讨论 2. 1 不运动突变体 af13-24 的筛选与性状分析 为获得衣藻不运动突变体，通过电转化的方式将 外源 DNA 片段 aphⅧ导入野生型衣藻 21gr 细胞之中． 从 3000 个转化子中，筛选获得运动缺陷突变体 7 个， 将其中的一株不运动突变体命名为 af13-24． 野生型 21gr 细胞，有两个等长的鞭毛，其长度大 约是 12 μm，见图 1( a) ． 与野生型细胞不同，大部分突 · 6011 ·

孙娟：莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白FT81调控鞭毛组装 *1107· 变体细胞在细胞分裂完成后不能正常分开，在液体培 运动突变体衣藻a1324是一种短鞭毛或鞭毛缺失 养基中细胞呈现出聚团生长的现象.在这些细胞团 突变 中，可以明显观察到短鞭毛的存在，见图1(b).经过 2.2突变体af1324的FT81基因缺陷 细胞壁溶解酶处理，突变体细胞可以从细胞团中分散 为了确定突变基因，将突变体基因组的RESDA- 开，单个的突变体细胞呈现出无鞭毛或者短鞭毛的多 PCR产物与pMD19T载体连接并测序，测序结果与莱 种性状，图1(c)~() 茵衣藻基因组(V4版本)进行比对.结果显示，突变体 (a) 的IFT81基因被外源基因破坏.IFI81基因有13个外 显子，其编码序列包括2052个碱基对，共编码683个 氨基酸，突变体的第五个外显子中插入了外源基因 aphⅧ，并且其中有52个碱基对被置换，见图2(a).因 此，突变体a1324被重新命名为81. 用Western Blot检测内源FT81蛋白的结果显示， FT81蛋白在野生型细胞中正常表达，而在突变体细 5 jm 胞中检测不到，见图2()，该结果与测序结果一致 为进一步确认F81基因缺陷是引起突变体性 状的原因，构建了含有完整IF81基因的互补载体， 见图2(b),并将环形互补质粒导入突变体81细胞 之中.从90个转化株中筛选得到三个性状恢复为野 60- (g) 生型的回复突变体，在这三株回复突变体中都可以 413-24 检测到IFT81HA融合蛋白的表达，见图2(d),其中 ☐21gr 0 的i81:FT81HA1#回复突变体被用于做后续实 验.另外，利用81蛋白的特异抗体，也可以在回 复突变株中成功检测到IFT81HA融合蛋白的表达， 见图2(e). 2.3突变体鞭毛的显微结构 电镜技术被用于进一步观察突变体81细胞鞭 毛的微观结构.将固定后的细胞切片，利用透射电镜 可以清晰地观察到衣藻鞭毛的显微结构，见图3.可以 鞭毛长度m 看出，野生型细胞鞭毛的横切面展示出典型的“9+2” 图1突变体与野生型衣藻微分干涉显微镜照片及鞭毛长度分 轴丝结构（图3(al),在过渡区有一个“H”型的结构 布图.(a)野生型21gr细胞：(b)突变体g1324细胞：(c)~ (图3(a3)),其纵切面则展示出了鞭毛内的FT粒子 ()细胞壁溶解酶处理后的突变体细胞：()突变体与野生型的 (图3(a2)). 鞭毛长度分布 突变体81细胞鞭毛的横切面展现“9+2”轴丝 Fig.1 DIC images of mutant and wild type cells,and flagellar length 结构（图3(b1)),鞭毛过渡区的“H”结构与野生型相 distribution:(a)wild type (21gr)cell:(b)mutant af1324 cells: 比有差异（图3(4）).短鞭毛的纵切面展示出有完整 (c)-(f)mutant cells after treatment of lysine:(g)flagellar length 鞭毛膜包被的轴丝，但是在部分短鞭毛的顶端出现了 distribution of mutants and the wild type 轴丝紊乱现象（图3(b2)~(b4)). 为了进一步分析突变体鞭毛的长度特征，用细胞 2.4鞭毛内运输蛋白FT81的定位 壁溶解酶处理获得分散的突变体细胞后统计鞭毛的长 确定鞭毛内运输蛋白IT81的定位是研究鞭毛组 度分布，见图1(g).在所有突变体细胞中，无鞭毛的 装机理的基础.回复突变体表达了FT81HA融合蛋 细胞占57%左右，鞭毛长度0~1m的细胞大约有 白，因此选用x-tubulin(微管蛋白)抗体（红色，对照） 20%,鞭毛长度1~2m的细胞有17%左右，鞭毛长度 和HA抗体（绿色），并利用免疫荧光实验检测. 2~3m的细胞约为4.5%，鞭毛长度3~4um的细胞 可以看出，HA荧光信号在野生型细胞(21gr)中 少于1.5%.与突变体不同的是，野生型21gr细胞的 检测不到，但同等条件下，回复突变体中的HA荧光信 两根等长的鞭毛主要分布于11~14um之间，70%左 号（绿色）集中于基体部位，鞭毛上也有点状的荧光信 右细胞的鞭毛都在11~14um:只有很少的细胞鞭毛 号分布，见图4.这些结果表明T81蛋白主要定位于 长度是小于11um或者大于14m.这些结果显示，不 基体，少量以点状形式沿着鞭毛分布

孙 娟: 莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白 IFT81 调控鞭毛组装 变体细胞在细胞分裂完成后不能正常分开，在液体培 养基中细胞呈现出聚团生长的现象． 在这些细胞团 中，可以明显观察到短鞭毛的存在，见图 1( b) ． 经过 细胞壁溶解酶处理，突变体细胞可以从细胞团中分散 开，单个的突变体细胞呈现出无鞭毛或者短鞭毛的多 种性状，图 1( c) ～ ( f) ． 图 1 突变体与野生型衣藻微分干涉显微镜照片及鞭毛长度分 布图． ( a) 野生型 21gr 细胞; ( b) 突变体 af13-24 细胞; ( c) ～ ( f) 细胞壁溶解酶处理后的突变体细胞; ( g) 突变体与野生型的 鞭毛长度分布 Fig． 1 DIC images of mutant and wild type cells，and flagellar length distribution: ( a) wild type ( 21gr) cell; ( b) mutant af13-24 cells; ( c) － ( f) mutant cells after treatment of lysine; ( g) flagellar length distribution of mutants and the wild type 为了进一步分析突变体鞭毛的长度特征，用细胞 壁溶解酶处理获得分散的突变体细胞后统计鞭毛的长 度分布，见图 1( g) ． 在所有突变体细胞中，无鞭毛的 细胞占 57% 左右，鞭毛长度 0 ～ 1 μm 的细胞大约有 20% ，鞭毛长度1 ～ 2 μm 的细胞有17% 左右，鞭毛长度 2 ～ 3 μm 的细胞约为 4. 5% ，鞭毛长度 3 ～ 4 μm 的细胞 少于 1. 5% ． 与突变体不同的是，野生型 21gr 细胞的 两根等长的鞭毛主要分布于 11 ～ 14 μm 之间，70% 左 右细胞的鞭毛都在 11 ～ 14 μm; 只有很少的细胞鞭毛 长度是小于 11 μm 或者大于 14 μm． 这些结果显示，不 运动突变体衣藻 af13-24 是一种短鞭 毛 或 鞭 毛 缺 失 突变． 2. 2 突变体 af13-24 的 IFT81 基因缺陷 为了确定突变基因，将突变体基因组的 ＲESDA￾PCＲ 产物与 pMD19-T 载体连接并测序，测序结果与莱 茵衣藻基因组( V4 版本) 进行比对． 结果显示，突变体 的 IFT81 基因被外源基因破坏． IFT81 基因有 13 个外 显子，其编码序列包括 2052 个碱基对，共编码 683 个 氨基酸，突变体的第五个外显子中插入了外源基因 aphⅧ，并且其中有 52 个碱基对被置换，见图 2( a) ． 因 此，突变体 af13-24 被重新命名为 ift81． 用 Western Blot 检测内源 IFT81 蛋白的结果显示， IFT81 蛋白在野生型细胞中正常表达，而在突变体细 胞中检测不到，见图 2( c) ，该结果与测序结果一致． 为进一步确认 IFT81 基因缺陷是引起突变体性 状的原因，构建了含有完整 IFT81 基因的互补载体， 见图 2( b) ，并将环形互补质粒导入突变体 ift81 细胞 之中． 从 90 个转化株中筛选得到三个性状恢复为野 生型的回复突变体，在这三株回复突变体中都可以 检测到 IFT81-HA 融合蛋白的表达，见图 2( d) ，其中 的 ift81∷IFT81-HA1 #回 复 突 变 体 被 用 于 做 后 续 实 验． 另外，利用 IFT81 蛋白的特异抗体，也可以在回 复突变株中成功检测到 IFT81-HA 融合蛋白的表达， 见图 2( e) ． 2. 3 突变体鞭毛的显微结构 电镜技术被用于进一步观察突变体 ift81 细胞鞭 毛的微观结构． 将固定后的细胞切片，利用透射电镜 可以清晰地观察到衣藻鞭毛的显微结构，见图 3． 可以 看出，野生型细胞鞭毛的横切面展示出典型的“9 + 2” 轴丝结构( 图 3( a1) ) ，在过渡区有一个“H”型的结构 ( 图 3( a3) ) ，其纵切面则展示出了鞭毛内的 IFT 粒子 ( 图 3( a2) ) ． 突变体 ift81 细胞鞭毛的横切面展现“9 + 2”轴丝 结构( 图 3( b1) ) ，鞭毛过渡区的“H”结构与野生型相 比有差异( 图 3( b4) ) ． 短鞭毛的纵切面展示出有完整 鞭毛膜包被的轴丝，但是在部分短鞭毛的顶端出现了 轴丝紊乱现象( 图 3( b2) ～ ( b4) ) ． 2. 4 鞭毛内运输蛋白 IFT81 的定位 确定鞭毛内运输蛋白 IFT81 的定位是研究鞭毛组 装机理的基础． 回复突变体表达了 IFT81-HA 融合蛋 白，因此选用 α-tubulin( 微管蛋白) 抗体( 红色，对照) 和 HA 抗体( 绿色) ，并利用免疫荧光实验检测． 可以看出，HA 荧光信号在野生型细胞( 21gr) 中 检测不到，但同等条件下，回复突变体中的 HA 荧光信 号( 绿色) 集中于基体部位，鞭毛上也有点状的荧光信 号分布，见图 4． 这些结果表明 IFT81 蛋白主要定位于 基体，少量以点状形式沿着鞭毛分布． · 7011 ·

·1108* 工程科学学报，第37卷，第8期 (a) HA蛋白 3UTR 微管蛋白 融合图 S'UTR ATTGAGCTGCACAAGAG (b) Kpn I BgⅡXbal I Hyg+ IFT81 gDNA with 5'UTR 日A c (d) 8121r 95 kDa- -FS1-2 081FT81-HA1 净81-IT81-HA3 +T81 72 kDa- anti-HA i81:IFT81-HAI nti-Tubulin 5 图4野生型细胞和回复突变体细胞的免疫荧光图片 Fig.4 Immunofluorescence images of wild type and rescued strain anti-IFT81 cells anti-Tubulin 细胞周期完成后生成两根等长的鞭毛(11~14μm) 图2突变体插入位点及相关蛋白表达电泳图.()突变体中 然而，缺乏完整FT81基因的突变体81却不能形成 phⅧ插入位点示意图，深色方框显示FT81基因的13个外显 鞭毛或者只能组装成两根很短的鞭毛。突变体81 子：(b)野生型IFT81基因互补载体示意图：(c)用FT81蛋白 的基因结构分析表明，外源基因aphⅧ整合到了IFT81 特异抗体检测野生型细胞21gr和突变体细胞81中FT81蛋白 基因的第五个外显子之中，并且替换了其中的52个碱 表达情况的Vestern blot:(d)用抗HA标签蛋白的抗体检测回 基对.蛋白免疫印迹分析表明，FT81蛋白在野生型细 复突变体中FT81HA融合蛋白的表达：(c)用FT81特异抗体 检测回复突变体中IFT81蛋白的表达 胞中可以正常表达，而在突变体细胞中则没有正常表 Fig.2 Insertion site information and Western blot information of 达.导入完整IFT81基因后，突变体鞭毛的性状又得 related proteins:(a)schematic diagram of insertion site,where the 以恢复为正常，说明该突变体的表型确实是由于 dark boxes represent the thirteen extrons of gene IF81:(b)sche- IFT81基因的缺失导致的. matic diagram of WT (wild type)IFT81 gene rescued plasmid:(c) FT81是非常保守的蛋白，在人类RPE!细胞中 the Western blot with anti-FT81 antibody showed IFT81 protein 利用RNAi技术抑制FI81会使得长有纤毛的细胞数 expression levels:(d)rescued strains tested by the Westem blot with anti-HA:(e)rescued strains tested by the Westem blot with anti- 量大大降低网.以上结果第一次在遗传上证明T81 IFT81 antibodies 蛋白在鞭毛组装过程中是至关重要的，其缺失会引起 鞭毛组装功能障碍. (al) (bl) n3) 2.6FT81和FT74/72蛋白模块运输机制 鞭毛和纤毛在生物的生命活动中都扮演着重要的 角色.在鞭毛生长的过程中，新的轴丝蛋白会添加在 轴丝的顶端，使得鞭毛不断生长.因为鞭毛内部缺乏 112 合成蛋白的相关机制，只能在细胞体内合成鞭毛相关 100nm 蛋白再运输到鞭毛内部完成组装，这就是鞭毛内运输 4 机制(FT机制).FT是一种双向运输系统，正向的运 输与ITB复合体有关，而反向的运输主要与FT-A 复合体相关.在鞭毛组装过程中，相关前体蛋白不断 地从胞体聚集到鞭毛的基部，与FT复合体结合之后 图3野生型细胞鞭毛和突变体81细胞鞭毛的显微结构 再进入鞭毛内，并在鞭毛的顶端完成组装。另外，在鞭 (al)~(a3)野生型细胞鞭毛：(b1)~(b4)突变体细胞鞭毛 毛长度的维持过程中，T系统对相关物质的输入和 Fig.3 Electron microscopy images showing the ultrastructure of wild 输出也是必要的7- type and mutant flagella:(al)-(a3)wild type;(bl)-(b4) 根据文献报道，TB复合体的核心蛋白包含一 mutant cells 个小的四聚体，该四聚体由两个T74/72和两个 2.5莱茵衣藻FT81蛋白的缺失引起鞭毛组装功能 FT81蛋白组成0.其中，FT81有结合微管蛋白的保 障碍 守位点(N端)以及与IFT74结合的卷曲螺旋(coiled.- 依赖于鞭毛内运输机制，野生型衣藻可以在每个 coil)区域，FT81和FT74蛋白结合并形成一个蛋白模

工程科学学报，第 37 卷，第 8 期 图 2 突变体插入位点及相关蛋白表达电泳图． ( a) 突变体中 aphⅧ插入位点示意图，深色方框显示 IFT81 基因的 13 个外显 子; ( b) 野生型 IFT81 基因互补载体示意图; ( c) 用 IFT81 蛋白 特异抗体检测野生型细胞 21gr 和突变体细胞 ift81 中 IFT81 蛋白 表达情况的 Western blot; ( d) 用抗 HA 标签蛋白的抗体检测回 复突变体中 IFT81-HA 融合蛋白的表达; ( e) 用 IFT81 特异抗体 检测回复突变体中 IFT81 蛋白的表达 Fig． 2 Insertion site information and Western blot information of related proteins: ( a) schematic diagram of insertion site，where the dark boxes represent the thirteen extrons of gene IFT81; ( b) sche￾matic diagram of WT ( wild type) IFT81 gene rescued plasmid; ( c) the Western blot with anti-IFT81 antibody showed IFT81 protein expression levels; ( d) rescued strains tested by the Western blot with anti-HA; ( e) rescued strains tested by the Western blot with anti￾IFT81 antibodies 图 3 野生型细胞鞭毛和突变体 ift81 细胞鞭毛的显微结构． ( a1) ～ ( a3) 野生型细胞鞭毛; ( b1) ～ ( b4) 突变体细胞鞭毛 Fig． 3 Electron microscopy images showing the ultrastructure of wild type and mutant flagella: ( a1 ) － ( a3 ) wild type; ( b1 ) － ( b4 ) mutant cells 2. 5 莱茵衣藻 IFT81 蛋白的缺失引起鞭毛组装功能 障碍 依赖于鞭毛内运输机制，野生型衣藻可以在每个 图 4 野生型细胞和回复突变体细胞的免疫荧光图片 Fig． 4 Immunofluorescence images of wild type and rescued strain cells 细胞周期完成后生成两根等长的鞭毛( 11 ～ 14 μm) ． 然而，缺乏完整 IFT81 基因的突变体 ift81 却不能形成 鞭毛或者只能组装成两根很短的鞭毛． 突变体 ift81 的基因结构分析表明，外源基因 aphⅧ整合到了 IFT81 基因的第五个外显子之中，并且替换了其中的 52 个碱 基对． 蛋白免疫印迹分析表明，IFT81 蛋白在野生型细 胞中可以正常表达，而在突变体细胞中则没有正常表 达． 导入完整 IFT81 基因后，突变体鞭毛的性状又得 以恢复 为 正 常，说 明 该 突 变 体 的 表 型 确 实 是 由 于 IFT81 基因的缺失导致的． IFT81 是非常保守的蛋白，在人类 ＲPE-1 细胞中 利用 ＲNAi 技术抑制 IFT81 会使得长有纤毛的细胞数 量大大降低［6］． 以上结果第一次在遗传上证明 IFT81 蛋白在鞭毛组装过程中是至关重要的，其缺失会引起 鞭毛组装功能障碍． 2. 6 IFT81 和 IFT74 /72 蛋白模块运输机制 鞭毛和纤毛在生物的生命活动中都扮演着重要的 角色． 在鞭毛生长的过程中，新的轴丝蛋白会添加在 轴丝的顶端，使得鞭毛不断生长． 因为鞭毛内部缺乏 合成蛋白的相关机制，只能在细胞体内合成鞭毛相关 蛋白再运输到鞭毛内部完成组装，这就是鞭毛内运输 机制( IFT 机制) ． IFT 是一种双向运输系统，正向的运 输与 IFT-B 复合体有关，而反向的运输主要与 IFT-A 复合体相关． 在鞭毛组装过程中，相关前体蛋白不断 地从胞体聚集到鞭毛的基部，与 IFT 复合体结合之后 再进入鞭毛内，并在鞭毛的顶端完成组装． 另外，在鞭 毛长度的维持过程中，IFT 系统对相关物质的输入和 输出也是必要的［17--18］． 根据文献报道，IFT-B 复合体的核心蛋白包含一 个小的 四 聚 体，该 四 聚 体 由 两 个 IFT74 /72 和 两 个 IFT81 蛋白组成［4］． 其中，IFT81 有结合微管蛋白的保 守位点( N-端) 以及与 IFT74 结合的卷曲螺旋( coiled￾coil) 区域，IFT81 和 IFT74 蛋白结合并形成一个蛋白模 · 8011 ·

孙娟：莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白FT81调控鞭毛组装 ·1109· 块，如同一辆运输车，可以将鞭毛组装所需要的蛋白 [5] Taschner M,Bhogaraju S,Vetter M,et al.Biochemical mapping 从基体部位运输到鞭毛的顶端.已有实验证实，莱茵 of interactions within the intraflagellar transport (IFT)B core 衣藻FT81需要同时拥有两个卷曲螺旋区域才能与 complex:IFT52 binds directly to four other IFT-B subunits.Biol Chem,2011,286(30):26344 FT7274发生相互作用，而FT72/74只要有一个卷曲 6]Bhogaraju S,Cajanek L.Fort C,et al.Molecular basis of tubulin 螺旋区域就可以与FT81发生相互作用 transport within the cilium by IFT74 and IFT81.Science,2013, 在莱茵衣藻突变体81中，插入的外源片段破坏 341(6149):1009 了FI81基因，导致严重的鞭毛组装缺陷.缺陷鞭毛 Pazour GJ,Dickert B L,Vucica Y,et al.Chlamydomonas IFT88 的显微结构表明，无鞭毛和短鞭毛突变体81细胞在 and its mouse homologue,polycystic kidney disease gene tg737, 微观结构也发生变化.通过对突变体插入位点的序列 are required for assembly of cilia and flagella.J Cell Biol,2000, 151(3):709 分析，我们发现外源片段并没有破坏F81基因中与 [8]Cole D G.The intraflagellar transport machinery of Chlamydo- 微管蛋白结合的部分，而是引起与微管结合保守位点 monas reinhardtii.Traffic,2003,4(7):435 之后的序列紊乱.这很可能使得FT81蛋白的翻译提 9]Hou Y,Qin H,Follit J A,et al.Functional analysis of an indi- 前终止，从而缺失了与T74结合的卷曲螺旋区域，进 vidual IFT protein:IFT46 is required for transport of outer dynein 而导致细胞内无法形成完整的FTB复合体.因此我 arms into flagella.J Cell Biol,2007,176(5):653 们推测，突变体不能形成正常的鞭毛可能是：FT81被 Do] Sager R,Granick S.Nutritional studies with Chlamydomonas re- inhardi.Ann NY Acad Sci,1953,56(5):831 破坏后引起FT复合体受损，IFT复合体从鞭毛内向顶 [1]Liang Y,Pan J.Regulation of flagellar biogenesis by a calcium 端运输蛋白的能力大大降低，进而导致鞭毛组装所需 dependent protein kinase in Chlamydomonas reinhardtii.PLoS 的蛋白供给不足，鞭毛组装无法正常完成.因此， 0ne,2013,8(7):69902 FT81和IFT74/72蛋白模块在衣藻鞭毛组装所需蛋白 [12]Gorman D S,Levine R P.Cytochrome f and plastocyanin:their 的运输过程中起着必不可少的作用. sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.Proc Natl Acad Sci USA.1965,54 3结论 (6):1665 03] Gonzalez-Ballester D,de Montaigu A,Galvan A,et al.Restric- (1)T81蛋白在衣藻鞭毛组装过程中必不可 tion enzyme site-directed amplification PCR:a tool to identify re- 少，且主要定位于基体部位和鞭毛上. gions flanking a marker DNA.Anal Biochem,2005,340(2) (2)FT81蛋白的缺失将会引起鞭毛微观结构的 330 改变 04] Berthold P,Schmitt R,Mages W.An engineered Streptomyces hygroscopicus aph7"gene mediates dominant resistance against 参考文献 hygromycin B in Chlamydomonas reinhardtii.Protist,2002.153 (4):401 [Pan J,Wang Q,Snell W J.Cilium-generated signaling and cilia- [15]Wang L,Piao T,Cao M,et al.Flagellar regeneration requires related disorders.Lab Inrest,2005,85(4):452 cytoplasmic microtubule depolymerization and kinesin-3.J Cell 2]RosenbaumJL,Witman G B.Intraflagellar transport.Nat Rer Si,2013,126(6):1531 Mol Cell Biol,2002.3(11):813 [16]Meng D,Cao M,Oda T,et al.The conserved ciliary protein B]Kozminski K G,Johnson K A,Forscher P,et al.A motility in the Bug22 controls planar beating of Chlamydomonas flagella.Cell eukaryotic flagellum unrelated to flagellar beating.Proc Natl Acad Sci,2014,127(2):281 Sci USA,1993,90(12):5519 [17]Marshall W F,Rosenbaum J L.Intraflagellar transport balances [4]Lucker B F,Behal R H,Qin H,et al.Characterization of the in- continuous turnover of outer doublet microtubules:implications traflagellar transport complex B core:direct interaction of the for flagellar length control.Cell Biol,2001,155(3):405 IFT81 and IFT74/72 subunits.J Biol Chem,2005,280 (30): [18]Scholey J M.Intraflagellar transport.Annu Rer Cell De Biol, 27688 2003,19:423

孙 娟: 莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白 IFT81 调控鞭毛组装 块［6］，如同一辆运输车，可以将鞭毛组装所需要的蛋白 从基体部位运输到鞭毛的顶端． 已有实验证实，莱茵 衣藻 IFT81 需要同时拥有两个卷曲螺旋区域才能与 IFT72 /74 发生相互作用，而 IFT72 /74 只要有一个卷曲 螺旋区域就可以与 IFT81 发生相互作用［4］． 在莱茵衣藻突变体 ift81 中，插入的外源片段破坏 了 IFT81 基因，导致严重的鞭毛组装缺陷． 缺陷鞭毛 的显微结构表明，无鞭毛和短鞭毛突变体 ift81 细胞在 微观结构也发生变化． 通过对突变体插入位点的序列 分析，我们发现外源片段并没有破坏 IFT81 基因中与 微管蛋白结合的部分，而是引起与微管结合保守位点 之后的序列紊乱． 这很可能使得 IFT81 蛋白的翻译提 前终止，从而缺失了与 IFT74 结合的卷曲螺旋区域，进 而导致细胞内无法形成完整的 IFT-B 复合体． 因此我 们推测，突变体不能形成正常的鞭毛可能是: IFT81 被 破坏后引起 IFT 复合体受损，IFT 复合体从鞭毛内向顶 端运输蛋白的能力大大降低，进而导致鞭毛组装所需 的蛋白 供 给 不 足，鞭 毛 组 装 无 法 正 常 完 成． 因 此， IFT81 和 IFT74 /72 蛋白模块在衣藻鞭毛组装所需蛋白 的运输过程中起着必不可少的作用． 3 结论 ( 1) IFT81 蛋白在衣藻鞭毛组装过程中必不可 少，且主要定位于基体部位和鞭毛上． ( 2) IFT81 蛋白的缺失将会引起鞭毛微观结构的 改变． 参 考 文 献 ［1］ Pan J，Wang Q，Snell W J． Cilium-generated signaling and cilia￾related disorders． Lab Invest，2005，85( 4) : 452 ［2］ Ｒosenbaum J L，Witman G B． Intraflagellar transport． Nat Ｒev Mol Cell Biol，2002，3( 11) : 813 ［3］ Kozminski K G，Johnson K A，Forscher P，et al． A motility in the eukaryotic flagellum unrelated to flagellar beating． Proc Natl Acad Sci USA，1993，90( 12) : 5519 ［4］ Lucker B F，Behal Ｒ H，Qin H，et al． Characterization of the in￾traflagellar transport complex B core: direct interaction of the IFT81 and IFT74 /72 subunits． J Biol Chem，2005，280 ( 30) : 27688 ［5］ Taschner M，Bhogaraju S，Vetter M，et al． Biochemical mapping of interactions within the intraflagellar transport ( IFT) B core complex: IFT52 binds directly to four other IFT-B subunits． J Biol Chem，2011，286( 30) : 26344 ［6］ Bhogaraju S，Cajanek L，Fort C，et al． Molecular basis of tubulin transport within the cilium by IFT74 and IFT81． Science，2013， 341( 6149) : 1009 ［7］ Pazour G J，Dickert B L，Vucica Y，et al． Chlamydomonas IFT88 and its mouse homologue，polycystic kidney disease gene tg737， are required for assembly of cilia and flagella． J Cell Biol，2000， 151( 3) : 709 ［8］ Cole D G． The intraflagellar transport machinery of Chlamydo￾monas reinhardtii． Traffic，2003，4( 7) : 435 ［9］ Hou Y，Qin H，Follit J A，et al． Functional analysis of an indi￾vidual IFT protein: IFT46 is required for transport of outer dynein arms into flagella． J Cell Biol，2007，176( 5) : 653 ［10］ Sager Ｒ，Granick S． Nutritional studies with Chlamydomonas re￾inhardi． Ann NY Acad Sci，1953，56( 5) : 831 ［11］ Liang Y，Pan J． Ｒegulation of flagellar biogenesis by a calcium dependent protein kinase in Chlamydomonas reinhardtii． PLoS One，2013，8( 7) : 69902 ［12］ Gorman D S，Levine Ｒ P． Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi． Proc Natl Acad Sci USA，1965，54 ( 6) : 1665 ［13］ Gonzalez-Ballester D，de Montaigu A，Galvan A，et al． Ｒestric￾tion enzyme site-directed amplification PCＲ: a tool to identify re￾gions flanking a marker DNA． Anal Biochem，2005，340 ( 2) : 330 ［14］ Berthold P，Schmitt Ｒ，Mages W． An engineered Streptomyces hygroscopicus aph 7″ gene mediates dominant resistance against hygromycin B in Chlamydomonas reinhardtii． Protist，2002，153 ( 4) : 401 ［15］ Wang L，Piao T，Cao M，et al． Flagellar regeneration requires cytoplasmic microtubule depolymerization and kinesin-13． J Cell Sci，2013，126( 6) : 1531 ［16］ Meng D，Cao M，Oda T，et al． The conserved ciliary protein Bug22 controls planar beating of Chlamydomonas flagella． J Cell Sci，2014，127( 2) : 281 ［17］ Marshall W F，Ｒosenbaum J L． Intraflagellar transport balances continuous turnover of outer doublet microtubules: implications for flagellar length control． J Cell Biol，2001，155( 3) : 405 ［18］ Scholey J M． Intraflagellar transport． Annu Ｒev Cell Dev Biol， 2003，19: 423 · 9011 ·