中草药Chinese Traditional and Herbal Drugs第36卷第3期2005年3月 ◆453· (sequence tagged sites)VNTR(variable number of tandem 先提出用发酵法来培养真菌菌丝体。1958年Szuecs第一个 repeat)、SCAR(sequence characterized amplified region)等， 用发酵缸来培养羊肚菌。从此药用真菌的生产跨人了大规模 在药用真菌的遗传育种、开发产品的鉴别中也逐步得到了应 工业化生产领域。国内较早报道的是1960年上海生理研究 用[~)。Terashima等1o应用AFLP技术对日本香菇的培养 所的陈美聿等人进行的香菇深层发酵研究。20世纪80年代 菌株进行了遗传多样性和菌株分型研究，评估了日本香菇主 后，国内外纷纷开展了有关药用真菌液体发酵（主要是深层 要培养菌株之间的DNA片断多肽性的变化范围，评价了 发酵)应用研究。适合液体发酵的药用真菌目前有70余种。 AFLP标记作为遗传标记在菌株分型上的实用性，并揭示了 除余知知)提到的60余种适合液体发酵的药用真菌外，还 它们之间的遗传相关性。6个AFLP引物在总共15株培养 有平菇、松乳菇、层卧孔菌、黑柄碳角菌、滑菇、构菌、玉草离 菌株中共检测出304个DNA片段，其中有179个DNA片 褶伞和金钱菌等。药用真菌的液体发酵，既可快速大量生产 段在？个或更多菌株间呈多态性。这些多态性DNA片段可 制备出多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、苷类、酚类、 以将所有的培养菌株区分开来。建立在AFLP数据基础上的 酶、核酸、氨基酸、蛋白质、维生素等多种生化物质：同时，还 群丛系统分析将它们分为了2个不同群组。同时，他们还在 可生产出菌龄整齐一致、生活力强、数量巨大的液体菌种，满 203个AFLP标记和2个结合型因子基础上建立了日本香 足扩大生产的需要。 菇的中密度遗传连锁图谱)。 药用真菌深层发酵生产工艺流程沿用了传统的发酵生 2.2原生质体技术：原生质体技术是利用原生质体诱变、杂 产工艺，即试管斜面菌种-→一级摇瓶种→二级种+三级种→ 交、转基因等创造变异新类型的生物技术。最早报道真菌原 发酵罐。有关培养基配方方面的研究包括碳源、氮源、碳氨 生质体分离的是荷兰的De Viies和Wessels,他们于1972年 比、pH值、无机盐、微量元素、维生素、生长因子、增黏剂等； 用从Trichoderma viride Pers.中制备的裂解酶分离了裂褶 有关发酵过程中参数控制的研究包括接种量、温度、搅拌速 菌的原生质体，随后又分离了双孢蘑菇和草菇的原生质体。 度、空气流量、糖含量、H值、纯度、活力、菌丝形状、发酵液 1980年后，随着商品脱壁酶的出现，从大型真菌中分离原生 中菌丝体个数和质量等。 质体的报道日益增多]。研究内容包括：原生质体的分离与 2.4酶工程技术：酶工程是利用酶的催化作用进行物质转 再生]、原生质体的融合、融合子的鉴定及遗传应用等。 化的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术， 原生质体技术作为改良药用真菌菌种的一个途径，主要 也就是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器的特定 应用在单核体杂交育种，远缘杂交育种、诱发突变型1幻、转 功能，借助工程学手段来提供产品的一项技术。药用真菌成 基因研究、克服品种退化等方面。随着分子生物学技术的不 分复杂，有药用成分，也有如蛋白质、果胶、淀粉、纤维等非必 断发展，药用真菌的原生质体技术在融合研究这一基础上与 须成分。这些成分一方面影响真菌细胞中药用成分的浸出， 分子生物学技术相结合得到了更广泛的发展。以脱去细胞壁 另一方面也影响中药液体制剂的澄清度。传统的提取方法 的裸露原生质体为材料，现已开展了外源基因的导入和转 (如煎煮、有机溶剂浸出和醇处理方法)提取温度高、提取率 化、DNA的分离和纯化、RFLP和PCR技术的应用、基因文 低、浪费乙醇、成本高、不安全：而选用恰当的酶，可通过酶反 库的构建等多项研究。 应较温和地将真菌组织分解，加速有效成分的释放提取，选 2.3发酵工程技术：发酵工程技术义称为微生物工程，是利 用相应的酶可将影响液体制剂的杂质如淀粉、蛋白质、果胶 用现代工程技术手段，利用微生物的特殊功能生产有用的物 等分解去除，也可促进某些极性低的脂溶性成分转化为糖苷 质，或直接将微生物应用于工业生产的一种技术。 类或易溶于水的成分而有利于提取。这是一项很有前途的新 药用真菌的发酵生产有固体发醇和液体发酵之分。固体 技术，完全适于工业化大生产。 发酵(solid fermentation)又称为“固体培养”，国外也曾有这 酶工程主要包括各类自然酶的生产开发技术，酶的分 种工艺，称为solid substrate fermentation(SSF),即固体基 离、纯化和鉴定技术，酶的固定化技术，酶分子改造技术，固 质发酵。国内目前固体发酵的基质多采用农副产品，工艺有 定化酶反应器的研制技术，酶的应用技术等。在药用真菌中， 两类：①去渣型工艺：用甘蔗渣、玉米芯、麦麸、米糠等作为基 能够通过工业化生产获得天然单一产物是人们追求的目标， 质，如猴头等多数药用真菌的发酵产品采用此工艺生产；② 但天然化合物结构复杂，常有多个不对称碳原子，合成难度 无渣型工艺：发酵后直接烘干的玉米粉作为基质，如亮菌、蜜 较大或合成条件苛刻；而酶工程为这类成分的获得提供了新 环菌等固体发酵的产品采用此工艺生产。在当前条件下，虽 的途径。酶工程技术在药用真菌的开发利用中如何发挥其作 然多种菌体发酵的制剂疗效并不亚于深层发酵，但有些部门 用，是今后值得研究的一个方向。 由于对它的理解不足而难以接受，严重影响了它的发展。尽 3生物技术在药用真菌研究和开发中的应用前景 管如此，药用真菌如猴头、云芝、蜜环菌等仍采取固体发酵的 目前生物技术在中药中的应用还十分有限，除了在细胞 生产方式。 工程和发酵工程方面有一定进展以外，基因工程刚刚起步， 液体发酵((liquid fermentation)也称液体深层发酵(Iiq- 而酶工程和蛋白质工程尚未涉及。因此，加强生物技术在中 uid submerged fermentation),是在抗生素发酵技术基础上 药基础和应用中的研究显得十分必要。药用真菌作为我国中 发展起来的，沿用了传统发酵生产工艺。1984年Humfeld首 药宝库中的一部分，生物技术在其开发利用中具有广阔的发中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 36卷第 3期 2005年 3月 ·453· (sequence tagged sites), VNTR (variable number of tandem repeat), SCAR (sequence characterized amplified region)等， 在药用真菌的遗传育种、开发产品的鉴别中也逐步得到了应 用〔'-'I. Terashima等[to」应用AFLP技术对日本香菇的培养 菌株进行了遗传多样性和菌株分型研究，评估了日本香菇主 要培养菌株之间的 DNA片断多肤性的变化范围，评价了 AFLP标记作为遗传标记在菌株分型上的实用性，并揭示了 它们之间的遗传相关性。6个 AFLP引物在总共 15株培养 菌株中共检测出 304个 DNA片段，其中有 179个 DNA片 段在 2个或更多菌株间呈多态性。这些多态性 DNA片段可 以将所有的培养菌株区分开来。建立在AFLP数据基础上的 群丛系统分析将它们分为了2个不同群组。同时，他们还在 203个 AFLP标记和 2个结合型因子基础上建立了日本香 菇的中密度遗传连锁图谱[117 2. 2 原生质体技术:原生质体技术是利用原生质体诱变、杂 交、转基因等创造变异新类型的生物技术。最早报道真菌原 生质体分离的是荷兰的De Viies和Wessels，他们于1972年 用从 Trichoderma viride Pers.中制备的裂解酶分离了裂褶 菌的原生质体，随后又分离了双抱蘑菇和草菇的原生质体。 198。年后，随着商品脱壁酶的出现，从大型真菌中分离原生 质体的报道日益增多[127。研究内容包括:原生质体的分离与 再生[13]、原生质体的融合、融合子的鉴定及遗传应用等。 原生质体技术作为改良药用真菌菌种的一个途径，主要 应用在单核体杂交育种，远缘杂交育种、诱发突变型[14]、转 基因研究、克服品种退化等方面。随着分子生物学技术的不 断发展，药用真菌的原生质体技术在融合研究这一基础上与 分子生物学技术相结合得到了更广泛的发展。以脱去细胞壁 的裸露原生质体为材料，现已开展了外源基因的导人和转 化、DNA的分离和纯化、RFLP和PCR技术的应用、基因文 库的构建等多项研究。 2.3 发酵工程技术:发酵工程技术又称为微生物工程，是利 用现代工程技术手段，利用微生物的特殊功能生产有用的物 质，或直接将微生物应用于工业生产的一种技术。 药用真菌的发酵生产有固体发醇和液体发酵之分。固体 发酵(solid fermentation)又称为“固体培养” ，国外也曾有这 种工艺，称为 solid substrate fermentation (SSF)，即固体基 质发酵。国内目前固体发酵的基质多采用农副产品，工艺有 两类:①去渣型工艺:用甘蔗渣、玉米芯、麦鼓、米糠等作为基 质，如猴头等多数药用真菌的发酵产品采用此工艺生产;② 无渣型工艺:发酵后直接烘干的玉米粉作为基质，如亮菌、蜜 环菌等固体发酵的产品采用此工艺生产。在当前条件下，虽 然多种菌体发酵的制剂疗效并不亚于深层发酵，但有些部门 由于对它的理解不足而难以接受，严重影响了它的发展。尽 管如此，药用真菌如猴头、云芝、蜜环菌等仍采取固体发酵的 生产方式。 液体发酵(liquid fermentation)也称液体深层发酵(liq￾uid submerged fermentation)，是在抗生素发酵技术基础上 发展起来的，沿用了传统发酵生产工艺。1984年Humfeld首 先提出用发酵法来培养真菌菌丝体。1958年Szuecs第一个 用发酵缸来培养羊肚菌。从此药用真菌的生产跨人了大规模 工业化生产领域。国内较早报道的是 1960年上海生理研究 所的陈美幸等人进行的香菇深层发酵研究。20世纪80年代 后，国内外纷纷开展了有关药用真菌液体发酵(主要是深层 发酵)应用研究。适合液体发酵的药用真菌目前有 70余种。 除余知知[Clb」提到的 60余种适合液体发酵的药用真菌外，还 有平菇、松乳菇、层卧孔菌、黑柄碳角菌、滑菇、构菌、玉覃离 褶伞和金钱菌等。药用真菌的液体发酵，既可快速大量生产 制备出多糖、多肤、生物碱、菇类化合物、街醇、昔类、酚类、 酶、核酸、氨基酸、蛋白质、维生素等多种生化物质;同时，还 可生产出菌龄整齐一致、生活力强、数量巨大的液体菌种，满 足扩大生产的需要。 药用真菌深层发酵生产工艺流程沿用了传统的发酵生 产工艺，即试管斜面菌种~一级摇瓶种~二级种~三级种~ 发酵罐。有关培养基配方方面的研究包括碳源、氮源、碳氮 比、pH值、无机盐、微量元素、维生素、生长因子、增勃剂等; 有关发酵过程中参数控制的研究包括接种量、温度、搅拌速 度、空气流量、糖含量、pH值、纯度、活力、菌丝形状、发酵液 中菌丝体个数和质量等。 2.4 酶工程技术:酶工程是利用酶的催化作用进行物质转 化的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术， 也就是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器的特定 功能，借助工程学手段来提供产品的一项技术。药用真菌成 分复杂，有药用成分，也有如蛋白质、果胶、淀粉、纤维等非必 须成分。这些成分一方面影响真菌细胞中药用成分的浸出， 另一方面也影响中药液体制剂的澄清度。传统的提取方法 (如煎煮、有机溶剂浸出和醇处理方法)提取温度高、提取率 低、浪费乙醇、成本高、不安全;而选用恰当的酶，可通过酶反 应较温和地将真菌组织分解，加速有效成分的释放提取，选 用相应的酶可将影响液体制剂的杂质如淀粉、蛋白质、果胶 等分解去除，也可促进某些极性低的脂溶性成分转化为糖昔 类或易溶于水的成分而有利于提取。这是一项很有前途的新 技术，完全适于工业化大生产。 酶工程主要包括各类 自然酶的生产开发技术，酶的分 离、纯化和鉴定技术，酶的固定化技术，酶分子改造技术，固 定化酶反应器的研制技术，酶的应用技术等。在药用真菌中， 能够通过工业化生产获得天然单一产物是人们追求的目标， 但天然化合物结构复杂，常有多个不对称碳原子，合成难度 较大或合成条件苛刻;而酶工程为这类成分的获得提供了新 的途径。酶工程技术在药用真菌的开发利用中如何发挥其作 用，是今后值得研究的一个方向。 3 生物技术在药用真菌研究和开发中的应用前景 目前生物技术在中药中的应用还十分有限，除了在细胞 工程和发酵工程方面有一定进展以外，基因工程刚刚起步， 而酶工程和蛋白质工程尚未涉及。因此，加强生物技术在中 药基础和应用中的研究显得十分必要。药用真菌作为我国中 药宝库中的一部分，生物技术在其开发利用中具有广阔的发