(1)涂片:取干净载玻片一块,在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水,按无菌操作法取菌涂片,左边涂苏云 金杆菌,右边涂大肠杄菌,做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杄菌浓菌液挑2-3环涂在左 边制成薄的涂面,将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面,注 意取菌不要太多。 (2)晾干:让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干 (3)固定:手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜) (4)染色:将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上,加复红染色1-2min (5)水洗:用水洗去涂片上的染色液 (6)干燥:将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干 (7)镜检:先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油一滴,将 油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 2、革兰氏染色 (1)涂片:涂片方法与简单染色涂片相同。 (2)晾干:与简单染色法相同 (3)固定,与简单染色法相同 (4)结晶紫色染色:将玻片置于废液缸玻片搁架上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1分 (5)水洗:倾去染色液,用水小心地冲洗 (6)媒染:滴加卢哥氏碘液,媒染1min。 (7)水洗:用水洗去碘液。 (8)脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20-25s至流出液无色,立即水洗 (9)复染:滴加蕃红复染5min (10)水洗:用水洗去涂片上的蕃红染色液。 (11)晾干:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 (12)镜检:镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性 (13)实验完毕后的处理 ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净,a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜 头擦2一3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。 (五)实验作业 给出 Bacillus thuringiensis和 Escherichia coli的形态图,并注明两菌的革兰氏染色的反应性。 (六)注意事项 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌:如脱色时间过 短,革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响, 难以严格规定 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后,应吸去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果 3.选用幼龄的细菌。G菌培养12h-16h,E.coli培养24h。若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳 性菌转呈阴性反应 实验四细菌的荚膜染色 (一)实验目的:学习细菌的荚膜染色法: (二〕实验原理:由于荚膜与染料间的亲和力弱,不易着色,通常采用负染色法染荚膜,即设法使菌体和背 景着色而荚膜不着色,从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上,故染色时一般不 加热固定,以免荚膜皱缩变形。 (三)实验器材（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云 金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑 2-3 环涂在左 边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取 2-3 环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注 意取菌不要太多。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰 2-3 次固定（以不烫手为宜） （4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色 1-2min。 （5）水洗：用水洗去涂片上的染色液 （6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将 油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 2、革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色 1 分 钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染 1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加 95%乙醇脱色 20—25s 至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染 5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 （13）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜 头擦 2—3 次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦 2—3 次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。 （五）实验作业 给出 Bacillus thuringiensis 和 Escherichia coli 的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。 （六）注意事项 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过 短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响， 难以严格规定。 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 3.选用幼龄的细菌。G +菌培养 12h-16h，E.coli 培养 24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳 性菌转呈阴性反应。 实验四 细菌的荚膜染色 （一）实验目的：学习细菌的荚膜染色法： （二）实验原理：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背 景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在 90%以上，故染色时一般不 加热固定，以免荚膜皱缩变形。 （三）实验器材